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Rev. Fac. Agron. (LUZ) 1996,13:285-292
Detección de virus en zonas productoras de tomate (Lycopersicon esculentum Mill) en Venezuela. I. Estados Aragua y Zulia1
A- Nava2; F. Ochoa3; G. Trujillo3; F. Geraud2; L. Hernández3; R. Lastra4; G. Rivas4
Recibido: 01-07-94 - Aceptado: 10-05-95
Resumen
Palabras clave: Detección, virus, tomate.
Abstract
Introducción
En el cultivo del tomate en Venezuela las enfermedades virales han causado daños económicos considerables; esta situación se ha agravado, ya que no existe control químico y sólo a través de resistencia genética es posible lograr superar ésta situación. En el país han sido señalados varios virus afectando el cultivo del tomate: el virus del mosaico amarillento del tomate (VMAT) (10), el virus del grabado del tabaco (TEV) (9), asociación del VMAT y el virus del mosaico del tabaco (TMV) en mayor proporción, y en menor proporción solos o combinados el virus del mosaico del pepino (CMV), el TEV y el TMV (12). En el año 1978 se señaló el rango de hospederos, transmisión y estudio de propiedades físicas del VMAT (11) y hasta el presente no ha habido ningún otro trabajo publicado que señale la presencia de nuevos virus, ni su dispersión en el país. Hoy en día la detección de virus se está realizando a través de técnicas rápidas como ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), hibridación con sondas de ADN viral (3, 7) tanto en muestras de plantas como del vector (8), y muy recientemente el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (13,14).
En este trabajo se planteó como objetivo detectar los virus asociados al cultivo del tomate en Venezuela, iniciándose el muestreo en las zonas tomateras de los estados Aragua y Zulia.
Materiales y métodos
Muestreo: Las zonas de producción de tomate de los estados Aragua y Zulia fueron muestreadas en los meses de octubre a diciembre y de febrero a abril de 1992, respectivamente. Se colectaron 22 muestras de tomate (TA), 12 de malezas (MA) y 2 de pimentón (PA) en 6 localidades del estado Aragua y 21 muestras de tomate (TZ) en localidades del estado Zulia. El muestreo se realizó tomando la precaución de usar las bolsas plásticas de colección como guantes, para no contaminar las muestras ,las cuales estuvieron constituidas por hojas jóvenes de plantas con síntomas aparentes de virosis y en algunos casos de plantas aparentemente sanas.
Una vez colectadas las muestras, se procedió a su traslado al laboratorio en una cava con hielo. Se secaron a temperatura ambiente entre dos hojas de papel absorbente; posteriormente se cortaron finamente y se dividieron en cuatro sub muestras: banco de virus, prueba de ELISA, prueba de hibridación y reserva .Las muestras se conservaron envueltas en toallas faciales, las cuales se colocaron en tubos de plástico con tapas, que contenían un tercio de su volumen con sílica gel, a una temperatura de 4ºc.
Detección de virus. ELISA: se utilizaron 6 estuches (Kits) de Agdia ELISA Assays, por escasez de material para detectar el PVX y PVY sólo se procesaron las siguientes muestras: tomate del estado Zulia y, tomate, pimentón y 2 malezas del estado Aragua. Para los virus CMV,TEV y TSWV se lograron procesa todas las muestras colectadas (cuadro 1).
El buffer de extracción se preparó con 2 ml de Tween 20 (s ), 4 g declara de huevo, 2 g de polivinil pirrolidol PM 10.000 (s ), y se llevó a 100ml con buffer fosfato salinoTween20 (PBST ween)
La muestra se preparó macerando el tejido seco y picado en buffer de extracción, en proporción 115(p/v, respectivamente), en bolsas de plástico con ayuda de un mazo de mortero. La enzima conjugada fue diluida con buffer de extracción en proporción 1: 4 y se preparó justo antes de su uso. La solución buffer o fenilennediamina (OPD), contiene 40ml de peróxido de hidrógeno al 30%,5. lg de ácido cítrico, 7.33 g de fosfatode sodio dibásico y un pH de 5.0.
Procedimiento: Una vez establecidas las posiciones en las placas de las muestras y controles positivos y negativos absolutos o bufferde extracción, se colocaron 100 m l demuestra preparada en cada celda, ya que las placas contienen el anticuerpo; sólo para las placas de PVX y PVY no se usaron duplicados demuestras. Las placas fueron incubadas a 250C por 2 h. Las placas se lavaron 3 veces con PBS - Tween, y se agregó en cada celda 100 m L de enzima conjugada, se incubó por 2h a250C, se lavó 3 ' veces con PBS. Tween, y se agregó en cada celda 100m L de solución OPD recién preparada; luego se incubó por 30 mina250 C. La reacción se detuvo cuando el color fue intenso en los control expositivos y sin color en los negativos absolutos, con 50 m L de ácido sulfúrico 3M en cada celda. Posteriormente, se tomaron las lecturas de absorbancia con un lector EI.ISA a 490 nmy se tomó como resultados positivos aquellos que tuvieron valores de absorbancia mayores a dos veces el valor de absorbancia del control negativo absoluto (4).
Hibridación: Esta parte de la investigación se llevó a cabo en los Laboratorios de Biología Molecular del Centro Agronómico tropical de Investigación y Enseñanza (CATIE), Costa Rica, para detectar geminivirus. Se utilizó la técnica de hibridación de ácidos nucleicos, empleando el sistema Photo Gene TM de BRL, con una sonda genérica biotinilada del virus chino del tomate según el procedimiento de Bio Nick Labehng System TM de GIBCO BRL (1), para pruebas con ácidos nucléicos, proporcionada por la Dra. Judith K. Brown (Universidad de Arizona, EE.UU.). Esta técnica se resume en cuatro fases: marcado de la sonda preparación de la muestra, hibridación y detección de la hibridación (3). Si la respuesta es positiva aparece una mancha grabada en la película, cuya intensidad será proporcional a la concentración de ácido nucléico presente en la membrana.
Esta técnica se probó en cinco muestras de tomate, cuatro malezas y dos de pimentón provenientes de Aragua y en cinco muestras de tomate del estado Zulia.
Cuadro 1. Repuesta positiva a virus X de la papa (PVX), virus Y de la papa (PVY), virus del mosaico del pepino (CMV) y virus del grabado del tabaco (TEV) a través de ELISA, en muestras de tomate, pimentón y malezas de los estados Aragua y Zulia
Estado |
Municipio |
Localidad |
Muestra* |
Virus detectados |
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PVX |
PVY |
CMV |
TEV |
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Aragua |
Zamora |
Valle de |
Tomate (3) |
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Parcela 57 |
Tomate (2) |
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Parcela 176 |
Tomate |
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Positivo |
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Casa Blanca |
Tomate |
Positivo |
Positivo |
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Parcela # 2 |
Tomate (2) |
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Bolívar |
San Mateo |
Tomate (2) |
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Zulia |
Páez |
El Escondido |
Tomate (8) |
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Puerto Rosa |
Tomate |
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El Molinete |
Tomate (6) |
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La Tigra |
Tomate (4) |
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El Espanto |
Tomate |
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El número entre paréntesis indica el número de muestras colectadas.
Resultados y discusión
De los virus detectados a través de ELISA sólo se presentan los resultados de detección de cuatro de los seis virus probados, debido a que para el TMV las lecturas de absorbancia fueron muy semejantes para los controles negativo absoluto y positivo (0.047 y 0.052 respectivamente); en el caso del TSWV el valor de la lectura del control negativo fue mayor que el control positivo (0.25 y 0.043, respectivamente). Por esta razón no se discuten los resultados para estos dos virus, ya que no se pudo comparar con los controles a pesar de haberse observado una respuesta colorimétrica.
Para el PVX hubo respuesta positiva en seis muestras del estado Aragua: dos de TA, dos de PA y dos de MA [Amaranthus sp. y Echinochloa colonum L. (Link)]. En todas las muestras del estado Zulia la respuesta fue negativa.
En la prueba de detección del PVY dos muestras de pimentón, cuatro de tomate y una de la maleza pira (Amaranthus sp.), provenientes del estado Aragua, fueron positivas; las muestra del estado Zulia no presentaron respuesta positiva.
Tres muestras de tomate y una de pimentón colectadas en Aragua fueron positivas para CMV, al igual que una sola muestra de El Escondido, Municipio Páez, estado Zulia.
Para el TEV se observó una respuesta positiva en una de las muestras de pimentón y en tres de tomate del estado Aragua y no se detectó el virus en las muestras del estado Zulia.
En la figura 1 se aprecia la presencia de geminivirus en las muestras de tomate de Aragua y Zulia, así como en las malezas Portulaca oleracea L. y Amaranthus sp., y también para Ipomoea sp. y Echinochloa colonum L. (Link), donde la respuesta fue positiva pero leve, todas las malezas provienen del estado Aragua, pudiéndose asociar esta detec ción con VMAT, dado que se utilizó una sonda genérica para geminivirus. La respuesta fue negativa para pimentón de Aragua.
Fig. 1. Detección de gemini virus en tomate, pimentón y malezas de los estados Aragua y Zulia, mediante hibridación no radioactiva de ácidos nueleicos*
a3-a7 Tomate del estado Zulia
e3-c7 Tomate del estado Aragua
e4 Portulaca oleracea L. del estado Aragua
e5 Ipomoea sp. del estado Aragua
e6 Amaranthus sp. del estado Aragua
e7 Echinochloa colonum L. (Link) del estado Aragua
gl Pimentón
g2 Pimentón
g6 Planta sana (Control negativo)
g7 Buffer de extracción (Control negativo absoluto)
b,d y f dilución 1:50
* La intensidad de la impresión será proporcional a la concentración de ácido nueleico presente en la membrana.
Analizando el conjunto de pruebas realizadas se puede observar que en una de las muestras de pimentón de Aragua se presentó PVY, PVY, CMV y TEV, en forma asociada, y no se presentó geminivirus. Las malezas colectadas en el estado Aragua presentaron: asociación de PVX, PVY y geminivirus en Amaranthus sp. PVX y geminivirus en Echinochloa colonum L. (Link), y geminivirus en Ipomoca sp. y Portulaca oleracea I. En tomate del estado Aragua se detectó PVY, CMV y TEV en forrna aislada y geminivirus, concordando con lo señalado por de Uzcátegui y Lastra (11). En el estado Zulia sólo se observó una muestra con CMV y cinco con geminivirus (cuadro 1).
En el estado Zulia sólo una muestra fue positiva para CMV y cinco para geminivirus, esto posiblemente debido al aislamiento geográfico con las zonas productoras endémicas para enfermedades virales como Lara, Guárico, Portuguesa, entre otras. Aunque la presencia de CMV y geminivirus pudiera ser preocupante, hay que destacar que sólo fue en una finca de una localidad, en la cual se constató que el material de transplante utilizado provenía de Quíbor, estado Lara, zona realmente endémica.
Dado que el vector de geminivirus es la mosca blanca (Bemisia tabaci, Gennadius, Homoptera: Aleyrodidae), y que el sistema de rotación de los productores en el Zulia es tomate, patilla y melón, donde el vector es plaga importante en esos cultivos, se requiere iniciar estudios con muestreos más detallados de la zona, de transmisión de poblaciones de insectos vectores, rango de hospederos (2, 5, 15), de detección con técnicas mas precisas como hibridación tanto en planta como en el vector (8), PCR (13, 14), cadena doble y simple de ARN (6, 16) que hacen posible un diagnóstico rápido y un monitoreo de la enfermedad y del vector en el campo.
Literatura citada
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