Rev. Fac. Agron. (LUZ). 1997,14:297-306

Detección de Xylella fastidiosa Wells et al. Por ELISA-DAS en Vid (Vitis vinifera L*) y malezas en viñedos del Municipio Mara, estado Zulia, Venezuela.

Livia Hernández¹ Francisco M. Ochoa Corona²

Recibido el 04-03-95 l Aceptado el 02-07-1996

Resumen

Se denomina Xylella fastidiosa Wells et al. a un grupo de bacterias Gram negativo, limitadas al xilema, que se desarrollan en medios de cultivo muy particulares. Para determinar la existencia de X fastidiosa en los hospederos en nuestro país, se realizó un estudio en viñedos del estado Zulia, durante 1993 sobre 16 cultivares de vid (Vitis vinifera L.) en los cuales fue posible observar síntomas similares a aquellos inducidos por este grupo bacterial, así como en malezas comunes asociadas al cultivo en la región. Extractos de ¡savia fueron utilizados para determinar la presencia de X. fastidiosa por medio de inmunoabsorción ligada a enzima en microceldas (ELISA). X fastidiosa se encontró presente en 8 de los cultivares de vid estudiados: ('French Colombard', 'Reisling', 'Early Muscat', 'Centenial seedless', 'Ruby seedless', 'Salt Creek', 'Alphonese Lavalle', e 'Italia'). Esta bacteria por primera vez es señalada en las malezas : Boerhavia diffusa L., Portulaca oleracea L., Merremia glabra (Aubl.) Hall F., Heliotropium fruticosum L., Heliotropium indicum L., Ipomoea crassicaulis (Benth.) Rob. y Passiflora foetida L.

Palabras claves: Xylella fastidiosa, ELISA, malezas, vid.

Abstract

Xylella fastidiosa Wells, et al is a Gram negative, xylem limited bacterial group, which grows in specific culture media. In order to study the presence of X. fastidiosa in Venezuela, a research in grape orchards of Zulia State was carried out in 1993 by sampling 16 grape cultivars (Vitis vinifera L.) that showed bacterial-like symptoms. The most common weeds asociated with the grapevine crop were included. Xylem extracts were used as samples to determine X. fastidiosa presence by enzyme linked immunosorbant assay (ELISA). X. fastidiosa was positive in 8 grape cultivars (French Colombard, 'Reisling, 'Early Muscae, 'Centenial seedless', 'Ruby seedless', 'Salt Creek', 'Alphonese Lavalle, e 'ltalia' ). This is the first report on the weeds Boerhavia diffusa L. , Portulaca oleracea L., Merremia glabra (Aubl.) Hall F., Heliotropium fruticosum L., Heliotropium indicum L., Ipomoea crassicaulis (Benth.) Rob. y Passiflora foetida L.

Key words: Xylella fastidiosa, ELISA, weeds, grapevine.

Introducción

Diferentes razas de Xylella fastidiosa Wells et al. han sido asociadas a enfermedades que causan pérdidas en algunos cultivos de importancia económica como la vid Vitis vinifera L.), la alfalfa (Medicago sativa L.), el duraznero (Prunus persica L.) y el ciruelo (Spondias purpurea L) (13), en árboles del medio urbano (8), como el olmo americano (Ulmus americana L.) (19), el roble (Quercus imbricaria Michx), así como en el Plantanus occidentalis L.(8).

Otros hospederos donde se ha encontrado esta bacteria son Conium maculatum L., Cyperus eragrotis Lam., Paspalum dilatum Poir, Fragaria vesca L., Montia linearis, (Dougl) Greene, Rubus procerus P.J. Muell, Vinca minor (11), Sambucus canadensis, Parthenocissus quinquefolia (L). Palnch y Ampelopsis arborea (L). Kochne (12).

X. fastidiosa pertenece a un grupo de bacterias con características muy particulares: Gram negativo, limitada al xilema, se desarrolla en diferentes medios artificiales de crecimiento, dependiendo del tipo de raza o aislamiento, como PD3, PW, BCYE y CS-20 (11). Fue descrita por primera vez en 1973 asociada a la "enfermedad de Pierce' en vid, circunstancia que dió inicio al estudio de la bacteria (5, 9). Estos autores han señalado que esta enfermedad está limitada a la zona norte del continente americano, específicamente en California, aunque se afirma que tanto la " enfermedad de Pierce" como el " Phony del duraznero son típicas de áreas tropicales y subtropicales (13).

En Costa Rica fueron detectadas bacterias limitadas al xilema en muestras de hojas de viñedos, similares alas encontradas en EE.UU. (6). En Venezuela, la bacteria causante de la "enfermedad de Pierce" fue reportada por primera vez en 1982, en 4 fincas del estado Zulia próximas a Maracaibo (El Potrón, "Los Panchos, Maribelo y Tocuyo), pero no se menciona en que variedades se detectó, y no se hace referencia a ningún hospedero alterno (16, 17). Recientemente esta bacteria ha sido localizada en árboles de cítricos y en 12 malezas comunes asociadas a estos cultivos (10).

Diferentes metodologías han sido utilizadas para el diagnóstico de esta bacteria, pero la prueba serológica más difundida y utilizada para diagnosticar X. fastidiosa en tejidos de plantas ha sido la técnica de inmuno-absorción ligada a enzima (ELISA) (4, 18), de utilidad en vid (11, 16, 17), duraznero, ciruelo, Vinca minor (11), cítricos (9, 15), olmo (19,20) así como plantas de jardín y roble (8).

En EE.UU. , el rendimiento del cultivo de la vid disminuyó entre 1981 y 1991 de 17.300 a 16.500 kg/ha. Esta reducción podría ser atribuida, entre otros factores, a la "enfermedad de Pierce', según datos obtenidos por FAO (1).

En los últimos años la producción de uvas en el país ha venido registrando un incremento, que coincide con el aumento del área cultivada y los rendimientos por unidad de superficie (3). El estado Zulia ocupó en 1980 el primer lugar en superficie sembrada y contribuyó con el 90% de la producción nacional de este cultivo (3). Hasta la fecha, conserva este liderazgo (Prof. Francisco Araujo. Fac. de Agronomía. Univ. del Zulia. Comunicación personal).

Debido a la importancia que presenta la producción de uvas en el estado Zulia y Venezuela, se hizo necesario la realización de este trabajo para determinar cuales cultivares de vid están afectados por la bacteria que causa la "enfermedad de Pierce" y cuales malezas le sirven como hospederos, ya que es posible que su presencia mantenga alguna relación con el decaimiento, marchitez y defoliación progresiva, observado con mucha frecuencia en los últimos años en viñedos zulianos con cultivares de vid introducidos desde California y Europa; y así mismo debido, a que desde 1982 ningún despistaje comprobatorio ha sido realizado.

Materiales y métodos

Selección y recolección de muestras. Se recolectaron secciones de tallo en ramas de plantas ubicadas en el campo, correspondientes a 16 cultivares de vid que presentaban una sintomatología muy similar a la «enfermedad de Pierce» (7, 21) (figura 1), en tres viñedos ubicados en el municipio Mara, estado Zulia (Centro Vitícola, la Perikle, La Solita), para completar un total de 21 muestras, además se recolectaron las malezas más comunes entre las hileras de plantas, las cuales se conservaron en excicatas para su posterior identificación y análisis.

Determinación de X. fastidiosa en cultivares de vid. La presencia de la bacteria se determinó en extractos de savia. Para ello se cortaron ramas de aproximadamente 12 cm de longitud por 0.5 - 1.0 cm de diámetro, luego se sellaron ambos extremos con una película de parafina para evitar la deshidratación de los tejidos. Las muestras se mantuvieron en cavas refrigeradas con hielo (4 - 6 ºC) hasta su traslado al laboratorio.

El extracto de savia fue obtenido conectando las secciones de tallo a una bomba de aire por medio de una manguera (figura 2). Aproximadamente a 2 cm de la conexión tallo-manguera se inyectó 1 ml de solución salina (8.5 g NaCI/L) estéril. Luego, la presión ejercida por la bomba, permitió a la solución atravesar la sección del tallo arrastrando consigo microorganismos presentes. Los extractos fueron refrigerados mientras culminó el proceso de extracción. Una vez obtenidos los extractos, se realizó la prueba ELISA-DAS utilizando un antisuero monoclonal producido sobre Pervinca rosea por la compañía Agdia, Inc. y como control positivo X. fastidiosa en tejido seco (Agdia, Inc.). Cepas de Pseudomonas sp., Erwinia sp. y Xanthomonas sp., provenientes del laboratorio de Bacteriología Vegetal de la Facultad de Agronomía, U.C.V. , fueron incluidas como controles alternos para descartar posibles reacciones cruzadas. Se colocaron 100 µL del extracto de cada muestra por celda. Luego se incubó a temperatura ambiente (35 ºC) durante 2 horas. La preparación de la enzima conjugada se hizo minutos antes del primer lavado diluyendo la enzima conjugada concentrada con el tampón conjugado PBS-TP (Phosphate buffer saline + Tween 20 + Polyvinyl pyrolidone 40. 000) en una relación 1:4. El lavado de las muestras se realizó con tampón PBS-TP, agregándose posteriormente 100 µL de la enzima conjugada preparada por celda. Se incubó nuevamente a temperatura ambiente por 2 horas y se hizo el segundo lavado de la misma forma, se agregaron 100 µL de la solución sustrato OPD (40 µL de peróxido de hidrógeno al 30 % en 100 mL de solución). Finalmente se incubó a temperatura ambiente por 10 min y se efectuó la lectura de los resultados en un espectrofotómetro MULTISKAN PLUS versión 1.4 calibrado a 490 nm de absorbancia con una placa de ELISA limpia. Se consideraron como reacciones positivas aquellas que superaron tres veces al blanco y dentro del margen de desviación del control positivo.

Determinación de X. fastidiosa en malezas. Se detectó X fastidiosa en tejidos de malezas mantenidos en excicatas por medio de ELISA tal y como se describió para el diagnóstico en savia. La muestra estuvo constituida por 0.6 g de tallos, ramas y hojas de las malezas en estudio. Estas se maceraron en morteros, a los cuales se agregó 4 mL de solución amortiguadora extractora (PBS-TP 0.05 % + 2 g de polivynil pirrolidone + 0.13 g de sulfito de sodio).

Figura 1. a) Plantación con aspecto sano. b) Plantación enferma. Aspectos de la recolección de malezas. c) Síntomas de necrosis en las nervaduras. d) Síntomas de defoliación y permanencia del pecíolo en el tallo.

Resultados

A nivel de campo X. fastidiosa pareciera estar asociada a síntomas de necrosis en nervaduras y bordes foliares, defoliación con permanencia del pecíolo en la rama y drástica reducción en los rendimientos. Esto último podría estar asociado a problemas de salinidad propios de la región, nemátodos y fitoplasma (MLO's), aún sin estudiar a profundidad. X. fastidiosa fue detectada en 8 de los 16 cultivares de vid estudiados (cuadro 1), ellos son: 'French Colombard', susceptible a la "enfermedad de Pierce" (2), 'Reisling', 'Early Muscae, 'Centenial seedIess', 'Ruby seedless' y 'Salt Creek'; material este proveniente de California, y plantado en el banco de germoplasma del Centro Vitícola del estado Zulia. Además, la bacteria estuvo presiente en los cultivares 'Alphonese Lavalle' e 'Italia', introducidos originalmente desde Italia, y cultivados en los viñedos La Perikle y la Solita, respectivamente.

La bacteria también se encontró presente en las especies de malezas: Boerhavia diffusa L., Portulaca oleracea L., Merremia glabra (Aubl) Hall. f.; dos especies pertenecientes a un mismo género, Heliotropium fruticosum L. y Heliotropium indicum L., Ipomoea crassicaulis (Benth.) y Passiflora foetida L. (cuadro 2).

Discusión y conclusiones

La detección de X. fastidiosa en 8 de los 16 cultivareis de vid estudiados y en 7 malezas, confirman los resultados de Jiménez (16, 17), quien realizó una temprana detección de esta bacteria apoyándose en la utilización de técnicas inmunológicas. No obstante, en sus reportes no se detallan las variedades ni hospederos alternos despistados serológicamente, información valiosa desde el punto de vista epifitiológico. Cabe mencionar que este señalamiento ha pasado inadvertido durante los últimos 9 años, período de tiempo suficiente para que el patógeno se haya diseminado ampliamente en términos geográficos y estableciera relaciones de vectorización con uno o más insectos, tal y como se intuye de las investigaciones realizadas por Hernández et al. (10), quienes detectaron esta bacteria en el estado Yaracuy infectando árboles cítricos y 12 malezas comúnmente asociadas a este cultivo.

Cuadro 1. Cultivares de vid y viñedos donde X. fastidiosa fue diagnosticada por ELISA-DAS.

Por otra parte, la adaptabilidad de X. fastidiosa a la condición tropical de Venezuela concuerda con las afirmaciones de Hopkins (13), quien la considera típica de ambientes tropicales y subtropicales. Pero poco podemos discutir sobre el origen y presencia de esta bacteria en el país, debido a que aún no está definido si X. fastidiosa está constituido por un grupo de bacterias autóctono del continente americano, o que contrariamente ingresó al país proveniente de otras latitudes en material vegetal introducido con propósitos comerciales y de investigación; principalmente desde California, EE.UU. Esta última opción resulta razonable si consideramos que la vid ha presentado la sintomatología que ha motivado esta investigación, durante los últimos años. En conclusión X. fastidiosa está presente en Venezuela y podría ser la causa de los síntomas descritos, así como de la baja producción y defoliación observada en vid. Su detección en dos puntos geográficos distantes y la diversidad de hospederos representa un serio riesgo para la viticultura y la citricultura nacional.

Cuadro 2. Malezas asociadas a viñedos con reacción positiva a X. fastidiosa.

Recomendaciones

Los resultados obtenidos sugieren la necesidad de realizar aislamientos y el cultivo puro de la bacteria en nuestro país, que permitan la elaboración de antisueros que faciliten la distinción de las razas presentes. También se hace necesario realizar pruebas de patogenicidad (Postulados de Koch) sobre diversos cultivares, que permitan precisar la sintomatología que induce esta bacteria bajo nuestras condiciones agroclimáticas y estimar en que forma estaría limitada la producción de vid.

También es recomendable ampliar el estudio epifitiológico que permita conocer los vectores y otros hospederos de X. fastidiosa que estén involucrados en la dispersión de la bacteria en las plantaciones de vid y cítricos, así como los períodos del año de mayor dispersión y expresión sintomatológica.

Finalmente, es necesario poner en marcha un programa regional (o nacional) de certificación para este y otros rubros frutícolas con importancia económica en el estado Zulia, que certifique la pureza genética y fitopatológica de las plantas que el fruticultor adquiere. Posiblemente varios microorganismos fitopatogénicos para la vid han sido introducidos desde EE.UU., Francia, Italia y más recientemente desde América del sur. De tal forma, que será necesario elaborar un censo de las enfermedades que afectan a la vid en Venezuela, y decidir cuales pueden ser controladas limpieza vía cultivo de meristemos.

Agradecimiento

Los autores desean expresar su agradecimiento a los Ing. Audo Cedeño y Carlos Sánchez de Fusagri - Zulia por su asistencia durante las visitas de campo. A los profesores Darisol Pacheco y Francisco Araujo de la Facultad de Agronomía de la Universidad del Zulia, por su colaboración durante la identificación de las malezas y orientación. A la Dra. Morela de Rolo del Instituto de Investigaciones Veterinarias del Fonaiap, Maracay, por su receptividad y apoyo a la investigación. A la Profesora Yonis Hernández de la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela, por facilitar los aislamientos de bacteria fitopatógena durante la investigación. Finalmente a la T.S.U. Deyanira Altuve por su valiosa asistencia mecanográfica.

Literatura citada

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