Rev. Fac. Agron. (LUZ): 1997, 14: 611-624

Detection of viruses from tomato (Lycopersicon esculentum Mill) productive zones in Venezuela. II. Andean states (M�rida, Tachira y Trujillo)

Recibido el 18-10-1996l Aceptado el 20-05-1997
1. Proyecto financiado por CONDES- CONICIT- FUNDACITE ZULIA.
2. Facultad de Agronom�a. Universidad del Zulia. Apto. 526. Maracaibo, Venezuela.
3. Facultad de Agronom�a. Universidad Central de Venezuela. Maracay, Venezuela.

A. Nava² , G. Trujillo³ , D. Chirinos^{2 y} G. Rivero²

Resumen

Con el prop�sito de detectar a trav�s de estuches de diagn�stico comerciales (Agdia) diez virus: X de la papa PVX (Potato X Virus), Y de la papa PVY (Potato Virus Y ), atrofia del brote terminal del tomate TAV (Tomato Aspermy Virus), manchado anillado del tomate ToRSV (Tomato Ringspot Virus), mosaico del tabaco TMV (Tobacco Mosaic Virus), manchado y marchitamiento del tomate TSWV (Tomato Spotted wilt Virus), mosaico del tomate ToMV (Tomato Mosaic Virus), rayado del tabaco TSV (Tobacco Streak Virus), mosaico del pepino CMV ( Cucumber Mosaico Virus) y mosaico amarillo del calabac�n ZYMV (Zuchini Yellow Mosaic Virus) fue realizado un muestreo en las zonas de producci�n de tomate m�s representativas de los estados M�rida, T�chira y Trujillo, colect�ndose 22, 28 y 18 muestras, respectivamente. En el estado M�rida se presentaron seis de los diez virus estudiados, siendo los m�s frecuentes ZYMV y TSV. En el estado T�chira se observaron los diez virus y los m�s frecuentes fueron TMV y ToMV, y por primera vez en cultivos de tomate en el pa�s se detectan ToSWV y ToRSV, lo que amerita estudios posteriores para su caracterizaci�n. En Trujillo se observ� la presencia de ocho de los diez virus estudiados, encontr�ndose con mayor frecuencia ZYMV, ToRSV, CMV y PVY.
Palabras claves: Virus, Tomate, Lycopersicon esculentum, Venezuela.

Abstract

Introducci�n

El tomate es una hortaliza de gran producci�n y consumo a nivel nacional, est� localizado principalmente en los estados Lara, Aragua y Gu�rico. Es un cultivo de alta rentabilidad y altos riesgos por la incidencia de plagas y enfermedades (3), siendo las enfermedades v�rales las de mayor importancia econ�mica.

Hasta la d�cada pasada se se�al� la presencia de algunos virus en las zonas de producci�n de tomate en el pa�s, tales como el virus del mosaico amarillo del tomate (VMAT) (7), el virus del grabado del tabaco TEV (Tobaco Each Virus) (6), asociaciones de VMAT con el virus del mosaico del tabaco TMV (Tobaco Mosaic Virus); virus del mosaico del pepino CMV (Cucumber Mosaic Virus), TEV con TMV en asociaci�n o en forma individual (8).

M�s recientemente se han reali-zado estudios de rango de hospederos (4) y fluctuaci�n de poblaciones de vectores como la mosca blanca (Bemisia tabaci) y su relaci�n con el VMAT en el estado Carabobo, encontr�ndose las mayores poblaciones del vector e incremento de la enfermedad en noviembre y diciembre, coincidiendo esto con la salida de lluvias, adem�s el rango de altura de mayor captura de insectos fue entre 10 y 60 cm, similar a la altura de las plantas de tomate (5). Tambi�n se est�n realizando investigaciones con la finalidad de encontrar resistencia gen�tica al VMAT en Lycopersicon chilense y se han obtenido h�bridos interespec�ficos con L. esculentum, utilizando cultivo de embriones, resultando este �ltimo resistente al virus (16).

En las �ltimas detecciones realizadas en las zonas productoras de Aragua se encontr� el Virus Y de la papa PVY (Potato Y Virus), virus X de la papa PVX ( Potato X Virus), CMV, TEV y VMAT en tomate, PVX, PVY, CMV y TEV en piment�n y en malezas PVX, PVY y VMAT. S�lo una muestra en Zulia present� CMV y cinco VMAT, esto causado posiblemente por traslado de material de siembra de zonas end�micas como el Valle de Quibor, estado Lara (15). Pero en la zona andina no se han se�alado trabajos de detecci�n de virus de tomate.

Dada las cuantiosas p�rdidas ocasionadas en el cultivo del tomate por la reducci�n en rendimiento causado por enfermedades v�rales, y la escasa informaci�n de la situaci�n actual de los virus asociados con el cultivo del tomate en Venezuela, se inici� este proyecto interinstitucional (Universidad del Zulia - Universidad Central de Venezuela) en 1993, con el prop�sito de detectar diez virus en la zona de producci�n del cultivo de tomate en los estados andinos: M�rida, T�chira y Trujillo.

Materiales y m�todos

Muestreo. El muestreo en zonas productoras de tomate de los estados andinos fue realizado en las �reas m�s representativas de los estados M�rida, T�chira y Trujillo (cuadro 1), en los meses de febrero y abril de 1994, diciembre de 1993, junio y noviembre de 1993, respectivamente. En el estado M�rida se cubrieron once fincas de seis localidades del municipio Sucre, el cual produce m�s del 80 % del total de la producci�n de tomate de ese estado, colectando un total de 22 muestras. En T�chira se tomaron veintiocho muestras de nueve fincas, en ocho localidades de cinco municipios del estado. Finalmente en el estado Trujillo se colectaron 19 muestras en ocho fincas de seis localidades de tres municipios . Las muestras fueron colectadas y tratadas como se describi� en trabajo anterior (15), tomando las muestras de plantas con s�ntomas aparentes de virosis en un �rea de tres hilos de cinco metros de largo, por finca.

Detecci�n de virus. Para esta fase se emplearon diez estuches (Kits) ELISA de diagn�stico comercial (2) para detectar los virus X de la papa PVX (Potato X Virus), Y de la papa PVY (Potato Virus Y), atrofia del brote terminal del tomate TAV (Tomato Aspermy Virus), manchado circular del tomate ToRSV (Tomato Ringspot Virus), mosaico del tabaco TMV (Tobacco Mosaic Virus), manchado y marchitamiento del tomate ToSWV (Tomato Spotted wilt Virus), mosaico del tomate ToMV (Tomato Mosaic Virus), rayado del tabaco TSV (Tobacco Streak Virus), mosaico del pepino CMV (Cucumber Mosaic Virus) y mosaico amarillo del calabac�n ZYMV (Zuchini Yellow Mosaic Virus). Los nueve primeros virus corresponden a DAS ELISA con peroxidasa ya descritos anteriormente (15), y el �ltimo a ELISA indirecto con fosfatasa alcalina (1).

Las muestras para detectar ZYMV (ELISA indirecto) se prepararon macerando el tejido seco y picado en buffer de extracci�n, en proporci�n 1:100 (p/v, respectivamente), en bolsas de pl�stico con cierre herm�tico con ayuda de un mazo de mortero. El buffer de extracci�n fue carbonato-bicarbonato de sodio (49 mM, pH 9.6) con azida de sodio al 0.02 % y polivinil-pirrolidona (PVP de peso molecular 40.000) al 2 %.

Cuadro 1. Ubicaci�n y n�mero de muestras colectadas por estado, localidad y finca.

(*) El n�mero entre par�ntesis indica el n�mero de registro de la finca.

El anticuerpo fue diluido en proporci�n 1:100 en buffer ECI, el cual fue preparado con buffer fosfato salino-tween 20 (PBST) ( 9.6 mM , pH 7.4) con alb�mina de bovino al 0.2 %, PVP al 2 % y azida de sodio al 0.02 %. La enzima conjugada se prepar� en una diluci�n 1:100 de enzima conjugada concentrada y buffer ECI. El buffer para el sustrato consisti� en 97 ml de dietanolamina, 0.2 g de azida de sodio y agua destilada hasta 1000 mL, a un pH 9.8 ajustado con �cido clorh�drico concentrado, en el cual se disolvi� 1 mg de p-nitrofenil fosfato (PNP) por mL de buffer.

Se colocaron 100 �L de muestra por celda, de manera duplicada, dejando en el dise�o de cada placa dos celdas para cada uno de los controles: positivos, negativos (planta de tomate de la variedad Margarita, sembrada en medios de cultivo in vitro para asegurar la no presencia de virus) y negativos absolutos o buffer de extracci�n; se dejaron incubando por 1 h a temperatura ambiente (TA), se lav� ocho veces con PBST; se colocaron 100 �L de anticuerpo por celda, se incub� a TA por 2 h, se lav� ocho veces con PBST; se dispensaron 100 �L de enzima conjugada preparada por cada celda, se incub� por 1 h a TA, se lav� ocho veces con PBST, en cada celda se colocaron 100 �L de sustrato se incub� por 1 h a TA y se par� la reacci�n con 50 mL de hidr�xido de sodio 3 M.

Posteriormente, se determin� la absorbancia en un lector ELISA (7520 Microplate Reader, Cambridge Technology Inc.) a 405 nm, consider�ndose positivas aquellas muestras con valores mayores a dos veces el valor promedio de absorbancia de los controles negativos (var. Margarita).

Para la formaci�n de los grupos de virus detectados por localidad dentro de cada estado, se realiz� un an�lisis de frecuencia de virus presentes en las diferentes fincas por localidad, se consider� como virus presentes aquellos que se detectaron en las muestras de una finca, considerando el mayor n�mero de virus presentes en las muestras.

Resultados y discusi�n

M�rida. En las siembras de tomate muestreadas en el Estado M�rida se formaron grupos de virus con uno hasta cinco virus presentes (figura 1, cuadro 2), ZYMV se present� en forma aislada en dos localidades: Los Estanques y Lagunillas, y en Chiguar� se detect� TAV. Dentro del grupo de dos virus presentes se encontr� ZYMV asociado con TSV en dos fincas de la localidad de San Juan y con ToMV en los Estanques. En Santa Filomena se detectaron TAV, TSV y ZYMV y en Los Estanques TAV, TSV y PVY. En el grupo de cuatro virus presentes se observ� la asociaci�n de TMV, ToMV y ZYMV con TSV y con PVY en los Cucharones y en Chiguar�, respectivamente. El �ltimo grupo formado por la asociaci�n de PVY, TAV, TMV, TSV y ZYMV se present� en Santa Filomena.

Figura 1. Ubicaci�n geogr�fica de las localidades muestreadas del estado M�rida.

En las seis localidades muestreadas del Estado M�rida se detectaron virus, pero es necesario hacer notar que tanto en las zonas bajas por debajo de 1 600 msnm (Los Estanques, San Juan y Lagunillas), como en las altas por encima de 1 600 msnm (Sta. Filomena, Los Cucharones y Chiguar�) predomin� la presencia de ZYMV y TSV. En las zonas altas tambi�n se observ� la asociaci�n de los dos virus antes mencionados con TMV y otros virus menos frecuentes como ToMV, TAV y PVY, form�ndose grupos de mayor n�mero de virus con respecto a las zonas bajas. En ninguna localidad se detect� PVX, ToRSV, ToSWV ni CMV.

El virus del mosaico amarillo del calabac�n (ZYMV) es considerado a nivel mundial, el pat�geno m�s importante en cucurbit�ceas; pertenece al grupo de los potyvirus al igual que el virus Y de la papa y ambos son transmitidos en forma no persistente por �fidos (14). El virus del rayado del tabaco (TSV), del grupo ilarvirus, causa manchas anilladas y malformaciones en tomate, es transmitido por Thrips tabaci, tiene amplia distribuci�n, pero generalmente no es end�mico (21). El virus atrofia del brote terminal del tomate causa da�os severos en hojas y produce frutos sin semillas, pertenece al grupo de los cucumovirus, est� generalmente relacionado con cultivos de crisantemos y es transmitido por �fidos en forma no persistente (10, 21).

Cuadro 2. Grupos de virus presentes (GVP) en el estado M�rida, por localidad y por n�mero de registro de la finca (FCA), detectados por ELISA. Continuaci�n.

(+) presencia de virus.

PVX = Virus X de la papa. ToSWV = Virus del manchado y marchitamiento del tomate.

PVY = Virus Y de la papa. To MV = Virus del mosaico del tomate.

TAV = Virus atrofia del brote terminal del tomate. TSV = Virus del rayado del tabaco.

ToRSV = Virus del manchado anillado del tomate. CMV = Virus del mosaico del pepino.

TMV = Virus del mosaico del tabaco. ZYMV = Virus del mosaico amarillo del calabac�n.

T�chira. En este Estado se formaron grupos de dos hasta siete virus en las ocho localidades muestreadas (figura 2, cuadro 3). En la zona de Capacho se presentaron PVX y PVY. Los grupos de tres virus se observaron en Santa Ana, Lobatera, La Llanada y Peribeca, donde se detectaron TMV, ToMV y ZYMV y en El Junco se present� la asociaci�n TAV, ToRSV y TMV en la finca Los Pinos. Los mismos virus asociados con ToSWV, ToMV y TSV se presentaron en la finca Bella Vista de esa misma localidad, formando el grupo de seis virus. Los virus: TAV, TMV, ToMV, TSV, CMV y ZYMV se presentaron en la localidad de Capachito. El �ltimo grupo formado por siete virus PVX, PVY, TMV, ToMV, TSV, CMV y ZYMV s�lo se observ� en EL Cobre.

Los diez virus a detectar estaban presentes en el Estado, pero los m�s frecuentes fueron TMV, ToMV, ZYMV, TAV, ToRSV y TSV. El primero y el segundo detectados en 19 y 16 mues-tras respectivamente y el tercero, cuarto, quinto y sexto detectados en 9, 8, 4 y 4 muestras, respectivamente. Se consider� de inter�s la asociaci�n TMV, ToMV y ZYMV ya que estuvo presente en cuatro de las ocho localidades muestreadas, pertenecientes a los municipios Ja�regui, Lobatera e Independencia, estos dos �ltimos ubicados uno al lado del otro (19).

Los virus del mosaico del tabaco y del tomate, anteriormente se�alados en otros trabajos como los m�s frecuentes en las zonas tomateras del pa�s (13), pertenecen al grupo de los tobamovirus, produciendo un mosaico en las hojas, causando distorsi�n en hojas j�venes y se transmiten mec�nicamente, de all� el alto n�mero de muestras con estos virus (9, 20).

En este Estado se detecta por primera vez en el pa�s, ToRSV en cuatro muestras y ToSWV en una muestra de tomate. El primero perte-nece al grupo de los nepovirus (18) y es transmitido por Xiphinema americanum, un nem�todo de amplia distribuci�n en el pa�s (17). El ToSWV es transmitido por Thrips tabaci en forma persistente, requiri�ndose una caracterizaci�n a trav�s de propiedades f�sicas, rango de hospederos y estudio de transmisi�n para estos dos �ltimos virus mencionados. Se han encontrado algunas especies de Lycopersicon menos susceptibles a la inoculaci�n mec�nica y por thrips del ToSWV, como L. pennellii, L. peruvianum y L. chilense (12) que pudieran ser incorporados en programas de mejoramiento gen�tico del cultivo, como se est� llevando a cabo en el Instituto Venezolano de Investigaciones Cient�ficas para VMAT (16).

Trujillo. En este Estado al igual que en T�chira no hubo infecciones simples, form�ndose grupos de dos hasta ocho virus en las seis localidades muestreadas (figura 3).

Figura 2. Ubicaci�n geogr�fica de ls localidades muestreadas en el estado T�chira.

Los virus TSV y ZYMV se detectaron en la localidad de Carache y las asociaciones TSV con TAV y PVX con TMV en dos fincas de la localidad de La Mesa. En Jaj� se observaron las agrupaciones de tres y cuatro virus, ToRSV, CMV, ZYMV y PVX, ToRSV, CMV, ZYMV en dos fincas bastante cercanas pertenecientes a un mismo productor con el mismo manejo, de all� la similitud en los virus encontrados. En Mucumbay y Las Adjuntas se presentaron en asociaci�n cinco virus, PVY, ToRSV, CMV, ZYMV con PVX y PVY, ToRSV, CMV, TSV con TMV, siendo semejantes los tres primeros virus en ambas localidades y en las cuales el material de siembra ten�a la misma procedencia los Valles de Quibor, estado Lara . En la Garita de Monay se present� la asociaci�n de ocho virus PVX, PVY, TAV, ToRSV, TMV, TSV, CMV y ZYMV. Los virus m�s frecuentes fueron ZYMV, ToRSV, CMV y PVY. En las seis localidades muestreadas no se presentaron los virus ToSWV y ToMV.

En los tres estados andinos fue constante la presencia del ZYMV. En Trujillo se observ� adem�s la presencia de CMV y ToRSV, en T�chira TMV y ToMV y en M�rida, TSV y TAV siendo estos resultados algo diferentes a los antes se�alados por autores (13) posiblemente debido a que los muestreos fueron realizados en zonas altas, donde quiz�s las condiciones ambientales modifican la distribuci�n y frecuencia de los virus (5).

Cuadro 3. Grupos de virus presentes (GVP) en el estado T�chira, por localidad y por n�mero de registro de la finca (FCA), detectados por ELISA

(+) presencia de virus.

PVX = Virus X de la papa. ToSWV = Virus del manchado y marchitamiento del tomate.

PVY = Virus Y de la papa. To MV = Virus del mosaico del tomate.

TAV = Virus atrofia del brote terminal del tomate. TSV = Virus del rayado del tabaco.

ToRSV = Virus del manchado anillado del tomate. CMV = Virus del mosaico del pepino.

TMV = Virus del mosaico del tabaco. ZYMV = Virus del mosaico amarillo del calabac�n.

Figura 3. Ubicaci�n geogr�fica de las localidades muestreadas en el estado Trujillo.

Cuadro 4. Grupos de virus presentes (GVP) en el estado Trujillo, por localidad y por n�mero de registro de la finca (FCA), detectados por ELISA. Continuaci�n.

(+) presencia de virus.

PVX = Virus X de la papa. ToSWV = Virus del manchado y marchitamiento del tomate

PVY = Virus Y de la papa. To MV = Virus del mosaico del tomate

TAV = Virus atrofia del brote terminal del tomate. TSV = Virus del rayado del tabaco

ToRSV = Virus del manchado anillado del tomate. CMV = Virus del mosaico del pepino

TMV = Virus del mosaico del tabaco. ZYMV = Virus del mosaico amarillo del calabac�n

Literatura citada

1. Agdia., 1995. Pathoscreen kit Agdia 1000 reagent set indirect ELISA, alcaline phosphatase. Elkhart, Indiana Inc. 6p.

2. Agdia., 1995. Pathoscreen kit DAS ELISA, peroxidase. Elkhart, Indiana Inc. 6 p.

3. Abreu E., A. Guti�rrez., H. Fontana., R. Cartay, L. Molina., A. Van Kesteren y M. Guillory. 1993. La Agricultura: componente b�sico del sistema agroalimentario venezolano. Fundaci�n Polar. 1^ra. Edici�n. Editorial Arte. Caracas.

4. Arnal E., F. Ramos y E. Debrot. 1993. Plantas hospederas de la mosca blanca Bemisia tabaci (Gennadius) en Venezuela. Agronom�a Tropical 43: 267-285.

5. Arnal E. , E. Debrot., R. Marcano, A. Montagne. 1993. Fluctuaci�n poblacional de moscas blancas y su relaci�n con el mosaico amarillo del tomate en una localidad de Venezuela. Fitopatolog�a Venezolana 6: 21-26.

6. Debrot. E. 1976. Estudios sobre el virus del grabado del tabaco en siembras de tomate en Venezuela. Agronom�a Tropical. 26: 322-335.

7. Debrot E., F. Herold, y F. Dao. 1963. Notas preliminares sobre el mosaico amarillento del tomate en Venezuela. Agronom�a Tropical 10: 33-41.

8. De Uzc�tegui R. y R. Lastra. 1978. Transmission and physical properties of causal agent of mosaico amarillento del tomate (tomato yellow mosaic). Phytopathology 68: 985-988.

9. Hollings M., H. Huttinga. 1976. Tomato mosaic virus. Descriptions of plant viruses No. 156. Commonwealth Mycological Institute and Association of Applied Biologists. Kew, Surrey, England. 6 p.

10. Hollings M., O. Stone. 1970. Tomato aspermy virus. Descriptions of plant viruses No. 79. Commonwealth Mycological Institute and Association of Applied Biologists. Kew, Surrey, England. 4 p.

11. Ie T. S.1970. Tomato spotted wilt virus. Descriptions of plant viruses No. 39. Commonwealth Mycological Institute and Association of Applied Biologists. Kew, Surrey, England. 4 p.

12. Krishna N. K. and D. E. Ullman. 1993. Evaluation of Lycopersicon germ plasm for tomato spotted wilt tospovirus resistance by mechanical and thrips transmission. Plant Disease 77: 938-941.

13. Lastra R. and R. De Uzc�tegui. 1975. Viruses affecting tomatoes in Venezuela. Phytopathology Z 84: 253-258.

14. Lecoq H. and J. M. Lemaire. 1991. Control of zucchini yellow mosaic virus in squash by cross protection. Plant Disease 75: 208-211.

15. Nava A., F. Ochoa, G. Trujillo, F. Geraud, L. Hern�ndez, R. Lastra, G. Rivas. 1996. Detecci�n de virus en zonas productoras de tomate (Lycopersicon esculentum) en Venezuela. I. Estados Aragua y Zulia. Revista de la Facultad de Agronom�a (LUZ) 13:285-292

16. Piven N., P. Mart�nez y D. Infantes. 1995. Resistencia en diferentes especies de la familia solanaceae al virus del mosaico amarillo del tomate. En Memorias del XII Congreso Venezo-lano de Bot�nica, Ciudad Bol�var, Venezuela del 21 al 27 de Mayo.

17. Renaud J. y E. Brice�o. 1995. Nuevas especies de Xiphinema (Nematoda: Longidonidae) en Venezuela. Revista Forestal Venezolana, 1: 89.

18. Stace-Smith R. 1970. Tomato Ringspot virus. Descriptions of Plant Viruses No. 18. Commonwealth Mycological Institute and Association of Applied Biologists. Kew, Surrey, England. 4 p.

19. Strauss E., 1995. Atlas pol�tico territorial de Venezuela. SPLANOS C.A. Maracaibo. 122 p.

20. Zaitlin M. and H. W. Israel. 1975. Tobacco mosaic virus (type strain). Descriptions of plant viruses No. 151. Commonwealth Mycological Institute and Association of Applied Biologists. Kew, Surrey, England. 5 p.

21. Zitter T. A., 1991. Compendium of tomato diseases. APS. Press. Minesota, 100 p.