Rev. Fac. Agron. (LUZ). 1998, 15: 319-329
Obtainment of antiserum against bean southern mosaic virus through a simple methodology
Recibido el 27-10-1997lAceptado el
20-04-1998
1. Parte del Trabajo Especial de Grado presentado por el primer autor para optar al
T�tulo de Ingeniero Agr�nomo en la Facultad de Agronom�a de la Universidad Central de
Venezuela.
2. Dirigir correspondencia a: Prof. Mario Jos� Garrido, Universidad Central de Venezuela,
Facultad de Agronom�a, Instituto de Bot�nica Agr�cola, Secci�n de Fitopatolog�a,
Apartado 4579, Maracay 2101-A, Venezuela.
Resumen
Palabras claves: Virus, purificaci�n, antisuero, caraota, Phaseolus vulgaris.
Abstract
Key words: Virus, purification, antiserum, bean, Phaseolus vulgaris.
Introducci�n
La caraota (Phaseolus vulgaris L.) es la leguminosa de mayor importancia destinada al consumo directo de la poblaci�n en Venezuela. Este cultivo es afectado por numerosos pat�genos, entre los cuales los virus revisten especial inter�s debido a las p�rdidas que ocasionan y porque el control qu�mico de los mismos es generalmente ineficaz (9).
M�s de cuarenta virus han sido reportados infectando a la caraota, de los cuales el virus del mosaico sure�o de la caraota (bean southern mosaic virus: BSMV) es uno de los m�s diseminados mundialmente. Esta virosis puede causar p�rdidas considerables en el rendimiento (m�s del 50%), debido a la reducci�n del n�mero y peso de la semilla producida por las plantas de caraota infectadas (9). En Venezuela es poca la informaci�n existente sobre este virus y su incidencia se ha incrementado notablemente en los �ltimos a�os, particularmente en el estado Aragua (8, 12).
Una v�a r�pida y segura de identificar los virus de plantas es a trav�s de pruebas serol�gicas. Sin embargo, para este tipo de prueba se requieren antisueros espec�ficos, y para producirlos se necesitan insumos y equipos de costo elevado (15). Esta situaci�n ha obligado, en la mayor�a de los casos, a que en nuestro pa�s deban importarse antisueros a un precio alto, lo cual dificulta los trabajos de diagn�stico y epidemiol�gicos, no s�lo en caraota, sino tambi�n en otros cultivos. Lo anterior se debe, fundamentalmente, a la escasez de laboratorios de virolog�a dotados de los equipos y materiales requeridos para este tipo de trabajo.
En Venezuela se han realizado algunas investigaciones dirigidas a la obtenci�n de antisueros mediante esquemas sencillos de purificaci�n con resultados muy halagadores (1, 11, 14).
Estos protocolos, desarrollados para algunos virus de inter�s en el pa�s, podr�an ser utilizados en laboratorios con limitaciones de equipos, no s�lo en Venezuela, sino tambi�n en otros pa�ses con limitaciones econ�micas o en v�as de desarrollo.
En atenci�n a lo antes expuesto, y en vista de la importancia que tiene la caraota en nuestro pa�s, se consider� de inter�s realizar esta investigaci�n, cuyo objetivo fue obtener antisuero contra el BSMV mediante la implementaci�n de una metodolog�a sencilla de purificaci�n.
Materiales y m�todos
Fuente de virus y mantenimiento de plantas. Como fuente del virus fueron utilizadas plantas de caraota cv Tacarigua infectadas mec�nicamente con un aislado identificado previamente como BSMV raza B (BSMV-B) (12).
Las semillas fueron sembradas en una mezcla est�ril de suelo y arena, en proporci�n 3:1 (v/v), respectivamente, contenida en materos pl�sticos de 1 L de capacidad (4-5 semillas/matero). Las plantas se inocularon mec�nicamente (10) a los 7-8 d�as de edad y se mantuvieron en un umbr�culo libre de insectos, a 26-28 �C y 65-70% HR, donde fueron regadas diariamente, cada 15 d�as fertilizadas con una soluci�n de una f�rmula completa (16-16-08; 2-3 g/L) y como medida preventiva adicional se efectuaron aplicaciones semanales (1/2 dosis comercial) de insecticida (Anthio), acaricida (Omite) y fungicida (Polyram-Combi), permitiendo mantenerlas en un estado �ptimo de crecimiento.
Purificaci�n parcial del virus. Para purificar parcialmente al BSMV-B se sigui� el procedimiento descrito en la figura 1. Este protocolo est� basado en la metodolog�a de Christie et al. (5) para concentrar part�culas virales, con algunas modificaciones de los autores. La siguiente descripci�n agrega algunas particularidades del procedimiento: las plantas fueron cosechadas a los 19-21 d�as despu�s de la inoculaci�n mec�nica (10), momento para el cual evidenciaban s�ntomas caracter�sticos de la infecci�n viral; sus hojas m�s j�venes fueron cortadas finamente y congeladas a -15 �C hasta su utilizaci�n (2-3 d�as despu�s de la cosecha).
Las hojas eran trituradas en una licuadora en presencia del buffer, en una relaci�n 1:2 (p/v), durante 5 min.
En el transcurso de la purificaci�n se utiliz� una centrifuga Sorvall RCL-B con un rotor SS-34. Todo el proceso se realiz� a una temperatura de 2-4 �C y no se hicieron ajustes de pH.
Pruebas de infectividad. Fueron realizadas con las siguientes fracciones de la purificaci�n: a) sobrenadante descartado despu�s de la precipitaci�n con polietilenglicol; b) �ltimo sedimento descartado; y c) suspensi�n parcialmente purificada (figura 1). Cada una de estas fracciones fue inoculada mec�nicamente en plantas j�venes (7-8 d�as de edad) de Phaseolus lunatus L. cv Henderson Bush, en el cual el BSMV-B induce lesiones locales necr�ticas (13). Tambi�n fueron inoculadas plantas de P. vulgaris cv Tacarigua, la cual manifiesta s�ntomas t�picos de mosaico ante la infecci�n con este virus (8).
Figura 1. Esquema de purificaci�n parcial del BSMV-B.
Obtenci�n del antisuero. Para obtener el antisuero contra el BSMV-B se inmuniz� un conejo de la raza Nueva Zelanda de 52 d�as de edad. Previo a la inmunizaci�n se obtuvo el suero normal, con la finalidad de constatar que el conejo a inmunizar no presentaba anticuerpos contra el BSMV-B. Adem�s este tipo de suero es utilizado en las pruebas serol�gicas como control.
a) Suero normal. Para obtener el suero normal, al conejo se le afeit� la oreja derecha, se le desinfect� con alcohol et�lico al 70%, se le dilataron las venas con xilol y se le aplic� vaselina para evitar que la sangre se dispersara en el borde de la oreja. El corte se realiz� en la vena marginal, pr�xima a la base de la oreja, permitiendo que la sangre goteara hacia tubos de vidrio est�riles. Seguidamente la sangre colectada se dej� durante 3 h bajo condiciones de laboratorio. Al cabo de ese tiempo se separaron cuidadosamente los co�gulos de las paredes de los tubos utilizando una varilla de vidrio est�ril; los tubos fueron colocados en un refrigerador a 4 �C hasta el d�a siguiente (3, 15).
El suero fue separado de los co�gulos y centrifugado a 3000 g durante 15 min. Por cada mililitro de suero normal se le agreg� una gota de azida de sodio al 1% como preservativo y se guard� congelado a -15 �C hasta su utilizaci�n (3).
b) Inmunizaci�n del conejo y tratamiento del antisuero. A los tres d�as despu�s de la extracci�n de la sangre para obtener el suero normal se inici� el proceso de inmunizaci�n. Al conejo se le suministraron cinco inyecciones intramusculares que conten�an 1 mL de suspensi�n viral + 1 mL de adyuvante incompleto de Freund a intervalos de seis d�as (3,15). La mezcla de ant�geno y adyuvante se efectu� minutos antes de cada inyecci�n.
La extracci�n de la sangre se realiz� de la siguiente manera: a) Un sangrado preliminar para conocer si el animal hab�a producido anticuerpos suficientes; �ste se efectu� cuatro d�as despu�s de la tercera inyecci�n. Se sigui� el procedimiento descrito en la obtenci�n del suero normal. b) El sangrado propiamente dicho se efectu� a los 11 d�as despu�s de la �ltima inyecci�n, mediante punci�n card�aca (3). En ambos casos la sangre fue tratada en la forma descrita para la obtenci�n del suero normal.
Al suero normal y al antisuero obtenido contra el BSMV-B se les determin� el t�tulo a trav�s de pruebas serol�gicas de doble difusi�n en agar (2). Para ello se hizo reaccionar diferentes diluciones de los sueros con diferentes diluciones de los ant�genos, y se determin� la m�xima diluci�n del antisuero capaz de detectar su hom�logo (15).
c) Absorci�n o saturaci�n del antisuero. Para absorber o saturar el antisuero se prepar� una suspensi�n de prote�nas de planta sana, macerando hojas j�venes de plantas de caraota (19-21 despu�s de la siembra) en un mortero fr�o y est�ril, sin adici�n de otras sustancias; el extracto era filtrado a trav�s de gasa y centrifugado a 3.000 g por 15 min. A partir del sobrenadante fueron preparadas varias diluciones (1/2, ... 1/16) con buffer fosfato de potasio 0,001 M, 0,85% NaCl, pH 7,5; cada una de ellas fue mezclada con igual volumen de antisuero (0,2 mL) y mantenidas a 4 �C durante 12 h. Luego, las diluciones fueron centrifugadas a 3.000 g por 15 min para eliminar precipitados. Cada diluci�n se prob� contra prote�na de planta sana a trav�s de pruebas de doble difusi�n en agar, con el fin de determinar la diluci�n m�s alta capaz de absorber todos los anticuerpos contra este tipo de prote�nas presentes en el antisuero. Una vez absorbido el antisuero, fue mezclado con glicerol en proporci�n 1:1 (v/v) y almacenado a -15 �C.
Serolog�a. Se utiliz� el m�todo de doble difusi�n en agar o de Ouchterlony (2). El medio de inmunodifusi�n consisti� de 0,8% de agar purificado, 0,85% de cloruro de sodio y 0,1% de azida de sodio en agua destilada. Una vez preparado el medio, 12-15 mL eran vertidos en cada caja de Petri pl�stica de 100 mm x 15 mm. Los huecos realizados en el gel med�an 5 mm de di�metro y estaban equidistantes entre si, separados 5 mm de un hueco central de igual medida (2).
Cuando se utiliz� material vege-tal infectado como ant�geno, las hojas j�venes de plantas de caraota (19-21 d�as despu�s de inoculadas) fueron maceradas en un mortero fr�o y est�ril, sin agregar buffer, y el extracto era filtrado a trav�s de gasa y centrifugado a 3.000 g por 15 min. El sobrenadante era utilizado en las pruebas. El testigo era obtenido de igual forma, pero a partir de plantas sanas.
Microscop�a electr�nica. Para corroborar la forma y tama�o de las part�culas virales, as� como para comprobar la concentraci�n viral en la suspensi�n parcialmente purificada, se procedi� de la siguiente manera: sobre una rejilla de cobre cubierta con una pel�cula muy delgada de nitrocelulosa (colodi�n) y carb�n evaporado se coloc� una gota de suspensi�n viral diluida y se dej� durante 1 min. Luego, se elimin� el exceso de l�quido de la rejilla con un papel filtro, se colore� con una gota de acetato de uranilo y despu�s de 2 min se elimin� el exceso de colorante con un papel filtro. Una vez seca la rejilla, aproximadamente a los 15 min, se observ� al microscopio electr�nico de transmisi�n (5, 10).
Resultados y discusi�n
En plantas de caraota `Tacarigua' el virus se multiplic� eficientemente, lo cual se evidenci� en las preparaciones a partir de la suspensi�n parcialmente purificada observadas al microscopio electr�nico. Una alta concentraci�n de part�culas isom�tricas de 28-30 nm de di�metro, caracter�sticas del BSMV (9, 13), fueron observadas en todos los preparados realizados con material de las diferentes purificaciones (figura 2).
El procedimiento implementado para purificar parcialmente al BSMV-B permiti� alcanzar los resultados esperados. Aunque no se determin� el rendimiento viral a partir del tejido vegetal, los resultados de las pruebas de infectividad evidenciaron que despu�s del proceso de precipitaci�n con polietilenglicol (PEG) la cantidad de part�culas virales que permanecieron en el sobrenadante descartado fueron escasas. Sin embargo, despu�s de resuspender el sedimento obtenido y centrifugar, a�n persist�a en el nuevo sedimento que se descarta cierta cantidad de viriones (cuadro 1). Probablemente esto ocurre por restos de PEG que quedan en el sedimento resuspendido y que hace que precipiten nuevamente algunas part�culas al centrifugar. Esto no afect� considerablemente el rendimiento final, ya que en la suspensi�n parcialmente purificada se observ� una alta concentraci�n de part�culas virales, lo cual fue evidenciado a trav�s del microscopio electr�nico (figura 2) y las pruebas de infectividad (cuadro 1).
Figura 2. Part�culas del BSMV-B observadas al microscopio electr�nico a partir de una suspensi�n parcialmente purificada diluida 1:3. La barra representa 100 nm.
Cuadro 1. Pruebas de infectividad sobre Phaseolus lunatus cv Henderson Bush de algunas fracciones de la purificaci�n parcial.1
| Fracci�n | Reacci�n2 |
| Sobrenadante descartado despu�s de la precipitaci�n con polietilenglicol | + |
| Ultimo sedimento descartado | ++ |
| Suspensi�n parcialmente purificada | +++ |
1Evaluaci�n realizada a los cuatro d�as despu�s de la inoculaci�n mec�nica. Fueron inoculadas tres plantas con cada fracci�n.
2+ = 1 a 2 lesiones locales necr�ticas(LLN)/hoja; ++ = 3 a 8 LLN/hoja. +++ = m�s de 9 LLN/hoja.
Estos resultados coinciden con lo citado por Christie et al.(5), quienes lograron aumentar el n�mero de part�culas observables en el microscopio electr�nico mediante un protocolo sencillo de concentraci�n para diferentes virus. La metodolog�a desarrollada en este estudio logr� ese objetivo, aparentemente en mayor cuant�a, lo cual es de gran inter�s para la obtenci�n de antisuero. Por otra parte, es importante destacar que durante el proceso de purificaci�n las part�culas virales no perdieron su infectividad, ya que las fracciones evaluadas indujeron s�ntomas caracter�sticos de la enfermedad sobre P. lunatus cv Henderson Bush (lesiones locales necr�ticas) y P. vulgaris cv Tacarigua (mosaico).
El t�tulo del suero normal fue cero, lo que evidencia que el conejo no presentaba anticuerpos contra un pat�geno hom�logo. En pruebas de doble difusi�n en agar se observ� una banda de precipitaci�n muy evidente entre el ant�geno viral (BSMV-B) y su antisuero. Sin embargo, tambi�n se observ� una banda muy tenue con prote�na de planta sana (figura 3), lo que demuestra que la purificaci�n del BSMV-B no fue total, quedando alg�n remanente de prote�na vegetal. Este resultado era de esperarse, ya que se utiliz� un protocolo sencillo de �purificaci�n�. Otros investigadores (1, 11, 14, 15) tambi�n han obtenido resultados similares con otros virus, recurriendo a la absorci�n del antisuero para eliminar los anticuerpos no espec�ficos contra el virus.
El t�tulo del antisuero para el primer y segundo sangrado fue de 1:1024. Es decir, que tres inyecciones eran suficientes para obtener un suero con el mismo t�tulo. Esto es debido en gran parte a que el BSMV es altamente inmunog�nico (13) y la concentraci�n de part�culas en cada inyecci�n era alta (1 mL de suspensi�n viral parcialmente purificada). Como el antisuero obtenido no fue completamente espec�fico, fue necesario absorberlo o saturarlo con prote�na de planta sana. Con una diluci�n de 1:4 de la prote�na de planta sana obtenida (utilizando el antisuero como diluente) se logr� precipitar todos los anticuerpos no espec�ficos, observ�ndose �nicamente la formaci�n de banda de precipitaci�n correspondiente al ant�geno viral y sus anticuerpos, sin reacci�n simult�nea con la prote�na vegetal (figura 3). Despu�s de la absorci�n del antisuero el t�tulo fue de 1:512.
La reacci�n del antisuero absorbido sin diluir fue positiva (banda de precipitaci�n bien visible), tanto con las suspensiones virales parcialmente purificadas, como con savia de plantas infectadas. Sin embargo, en este �ltimo caso las bandas fueron ligeramente m�s tenues, debido a que la concentraci�n viral era considerablemente menor con respecto a las suspensiones parcialmente purificadas (figura 3).
El antisuero absorbido permiti� detectar f�cilmente al BSMV-B en muestras procedentes del campo (plantas j�venes y viejas) mediante pruebas serol�gicas de doble difusi�n en agar. Este tipo de prueba permite detectar a este virus con bastante precisi�n, debido a que no est� relacionado serol�gicamente con otros miembros del grupo sobemovirus, ni con otros virus pertenecientes a otros grupos. No obstante, todas las razas del BSMV est�n relacionadas serol�gicamente entre s� (13). Por otra parte, ser�a interesante probar el antisuero obtenido a trav�s de otras t�cnicas serol�gicas m�s sensibles, como ELISA, ya que el t�tulo del mismo es relativamente alto y se utilizar�a menos antisuero.
Figura 3. Prueba de doble difusi�n en agar utilizando antisuero (S) contra el BSMV-B: sin absorber (izquierda) y absorbido (derecha). Los huecos perif�ricos conten�an virus parcialmente purificado (a) y savia de plantas de caraota: sanas (b) e infectadas con BSMB-B (c).
Algunos investigadores (4, 6, 7) han obtenido antisueros contra el BSMV con t�tulos de 1:512, determinados mediante pruebas de doble difusi�n en agar. Estos sueros han sido obtenidos mediante metodolog�as que hacen uso de equipos especializados de alto costo, las cuales han tenido como base la precipitaci�n de las prote�nas mediante el uso de ultracentr�fugas. Sin embargo, en esta investigaci�n, con una metodolog�a sencilla y sobre la base de la precipitaci�n de las prote�nas con polietilenglicol, se ha obtenido un antisuero con igual t�tulo, lo cual es de gran inter�s en nuestras condiciones. Por otra parte, ser�a importante evaluar este protocolo para otros virus de caracter�sticas similares y estudiar la posibilidad de obtener antisueros.
En conclusi�n, los resultados obtenidos en este trabajo coinciden con lo logrado por Alagares et al. (1), Ochoa y Trujillo (11) y Trujillo et al. (14); es decir, se pueden obtener antisueros contra algunos virus de plantas mediante t�cnicas simples y en laboratorios modestos. En tal sentido, la obtenci�n de antisuero contra el BSMV-B mediante una metodolog�a sencilla puede ser de gran ayuda en el diagn�stico y estudios sobre la epidemiolog�a de este virus, particularmente en laboratorios o pa�ses que confronten problemas econ�micos para la obtenci�n de materiales y equipos.
Agradecimientos
Los autores desean expresar su gratitud al Dr. E. Debrot, Lic. M. Alfaro y Tecn. F. Centeno (Fonaiap-Ceniap, Laboratorio de Virolog�a Vegetal, Maracay) por su valiosa ayuda en la parte de microscop�a electr�nica. Igualmente, a la profesora L. Fari�as (UCV, Fac. Agronom�a, Laboratorio de Enzimolog�a, Maracay), por permitir el uso de algunos equipos y materiales.
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