Rev. Fac. Agron. (LUZ). 1999, 16: 495-508
|
Cepa | Lupinus | Nodulación | Pigmentación |
5 | mutabilis | - | + |
505 | " | ++++ | - |
102 | " | + | - |
103 | " | - | - |
105 | " | ++++ | + |
110 | " | ++ | - |
113 | " | ++ | - |
120 | " | +++ | - |
2004 | meridanus | - | - |
2005 | " | ++++ | - |
2006 | " | ++++ | + |
2007 | " | ++++ | + |
2011 | " | - | - |
2012 | " | ++++ | - |
3004 | " | +++ | - |
3009 | " | ++++ | - |
3010 | " | ++ | - |
4008 | " | ++++ | - |
4013 | " | + | - |
4018 | " | - | + |
5004 | " | + | - |
5017 | " | ++++ | - |
Nodulación: +pocos nódulos, ++algunos nódulos, +++numerosos nódulos, generalmente pequeños, ++++numerosos nódulos grandes y pequeños. - sin nódulo Pigmentación : +presencia de pigmentos, -ausencia de pigmentos.
Cuadro 2. Cepas de otras especies de Rhizobium y Bradyrhizobium.
Cepa | Genero | Infectividad | Efectividad | Fuente |
41 | R. meliloti | ++ | ++ | INRA |
L5-30 | " | + | ++ | " |
B19 | " | + | ++ | INTA |
A16 | R. trifolii | + | ++ | " |
2453 | Bradyrhizobium sp. * | Nc ** | Nc | CIAT |
* Aislado de Macroptillium sp.
** No conocida.
Perfil de plásmidos. El perfil de plásmidos de las cepas bacterianas fue visualizado de acuerdo al método de la lisis alcalina descrito en Maniatis et al. (17) y modificado al permitir la precipitación del ADN en alcohol isopropílico durante 24 h. El estudio se realizó en las cepas 5, 107, 102, 105, 103, 118, 120, 505, 508, 2004, 2006, 2007, 2011, 2012, 4008, 4013 y 4018 de Bradyrhizobium sp; en las cepas 41 y L530 de Rhizobium meliloti y C58 de Agrobacterium tumefaciens.
De las 22 cepas de Bradyrhizobium sp. estudiadas, 17 fueron infectivas, mostrando gran variabilidad en esta característica como se muestra en los cuadros 1 y 3. Para determinar las diferencias se analizó la capacidad de nodulación en 21 cepas al igual que el número de nódulos y el peso seco (cuadro 3). El 27,2 % de las cepas no es infectiva y el número de nódulos fue variable de 4, 6, 10,11, 13, 17, 23, 26, 32 y 46, presentándose éste último con una frecuencia de 4,76 % (cuadro 3). Los números de nódulos 7 y 14 aparecieron con una frecuencia de 9,52 % ambos. Cuando se compara el peso seco de las diferentes cepas (cuadro 3) se observa que la cepa 4018 no es nodulante y tiene menor cantidad de materia seca (8,93 mg) que el control (11,00 mg), lo que puede ser explicado por diferencias intrínsecas de las plantas. La cepa 102 que es nodulante, pero con 10 nódulos pequeños y 1 mediano, acumuló una cantidad de materia seca (13,99 mg) muy cercana al control; posiblemente las características intrínsecas y nódulos ineficientes pueden explicar este comportamiento. Las cepas 3009 y 120 presentan la relación Nd.Pd / Nº Pt muy parecidas, pero la acumulación de materia seca y el número de nódulos es muy diferente, indicando una alta efectividad de los 7 nódulos de la cepa 120. Las cepas 3004, 2007 y 105 muestran NdPd / Nº Pt similares, pero 3004 acumuló menor cantidad de materia seca. Entre 113 y 505 el incremento de peso seco no es muy grande. La cepa 2006 presenta la mayor acumulación de materia seca (37,22 mg/pt), por encima de 5017 y 2006 y forma el mayor número de nódulos, 46 en total.
No se observa ninguna regularidad entre la capacidad de nodulación (presencia, Nº y tamaño de nódulos) y la capacidad de incorporar materia seca en las diferentes cepas . La cepa 3010 con solo 4 nódulos incorpora 22,03 mg de materia seca, mientras la 2006 con 46 nódulos de diferente tamaño incorpora 37, 22 mg y la 5017 con 31 nódulos (23 grandes) solo incorpora 37,17 mg de materia seca. Sin embargo, cepas como 2005, 2006 y 2007, todas aisladas de una misma planta, presentan gran cantidad de nódulos y alta eficiencia medida como incorporación de materia seca. Las cepas 2006, 2007, 5004 y 5017 también presentan resistencia a un amplio espectro de antibióticos (cuadro 4) lo cual permitiría la inoculación de estas cepas y un buen rendimiento en la fijación y seguimiento en el suelo en condiciones de laboratorio. La capacidad de nodulación y la eficiencia de una cepa son finalmente el resultado de las interacciones especificas de genotipo bacteriano - genotipo vegetal y de condiciones del medio ambiente que permiten la expresión de los genes simbióticos. Por lo tanto, en una población de bradirizobios como la estudiada es normal conseguir diferencias de este tipo.
Resistencia a antibióticos. El cuadro 4 presenta los patrones de resistencia/sensibilidad a antibióticos de 10 cepas de Bradyrhizobium sp. dos de R. meliloti, una de R. trifolii y una de R. cowpea.
Todas las cepas de Bradyrhizobium sp., presentan resistencia a más de un antibiótico. Las cepas 2006 y 2007 poseen resistencia a los 7 antibióticos y la cepa 2012 mostró resistencia para los 6 antibióticos examinados; estas cepas fueron aisladas de la misma planta. Las cepas 5004 y 5017 tienen un patrón de resistencia parecido, aunque 5017 no es resistente a rifampicina. Los patrones de resistencia de 105, 110, 3010 y 4017 son muy diferentes entre ellos. Se observan grupos de patrones tales como 2006, 2007 y 2012 con resis-tencia a rifampicina, cloranfenicol, estreptomicina, vancomicina, espectinomicina y ampicilina; la resistencia a kanamicina no fue probada en la cepa 2012. Las cepas 105, 110 y 2004 tienen el mismo nivel de resistencia a espectinomicina, pero 105 y 110 se diferencian de 2004 porque son resistentes a los niveles de cloranfenicol ensayados. La cepa 2004, a pesar de ser aislada de la misma planta que 2006 y 2007, no presenta resistencia a cloranfenicol, kanamicina, vancomicina y ampicilina. En la cepa 3010 no fue probada la resistencia a kanamicina y vancomicina. y la cepa 4017 es sensible a rifampicina, cloranfenicol y vancomicina, siendo resistente solo a espectinomicina. Las cepas 5004 y 5017 son muy parecidas, siendo sensible ambas a kanamicina, 5004 tiene menor nivel de resistencia a cloranfenicol y 5017 es sensible a rifampicina.
Cuadro 3. Peso seco, tamaño y Nº de nódulos, Nº de nódulos ponderados/ planta y peso seco trat/ peso seco control de plantas de Lupinus meridanus inoculadas con cepas de Bradyrhizobium sp.
Tratamiento | Peso seco (mg) | Tamaño de nódulos | Ndpd / Pt | Incremento de peso seco |
||
G | M | P | ||||
Control | 11,00 | - | - | - | 0,000 | 0,00 |
4018 | 8,93 | - | - | - | 0,000 | -2,07 |
102 | 13,99 | - | 1 | 10 | 3,000 | 2,99 |
2012 | 16,62 | - | - | - | 0,000 | 5,62 |
2011 | 16,80 | - | - | - | 0,000 | 5,80 |
5 | 18,69 | - | - | - | 0,000 | 7,69 |
103 | 19,63 | - | - | - | 0,000 | 8,63 |
2004 | 19,82 | - | - | - | 0,000 | 8,82 |
3004 | 21,57 | 2 | 2 | 3 | 1,857 | 10,57 |
3010 | 22,03 | 4 | - | - | 0,800 | 10,03 |
110 | 24,30 | - | - | - | 0,000 | 13,30 |
4013 | 24,50 | 1 | - | 5 | 0,889 | 13,50 |
3009 | 28,21 | - | 3 | 20 | 2,189 | 17,21 |
5004 | 28,60 | 7 | 2 | 5 | - | 17,60 |
113 | 29,03 | 8 | 4 | 5 | 4,625 | 18,03 |
2005 | 29,35 | 13 | 7 | 6 | 5,900 | 18,35 |
120 | 30,01 | 2 | 1 | 4 | 2,400 | 19,01 |
505 | 33,76 | 13 | 0 | 1 | 4,444 | 22,76 |
2007 | 34,63 | - | 1 | 9 | 1,222 | 23,63 |
105 | 35,02 | - | 2 | 11 | 1,660 | 24,02 |
5017 | 37,17 | 23 | 6 | 3 | 8,400 | 26,17 |
2006 | 37,22 | 18 | 13 | 15 | 10,556 | 26,22 |
Tamaño de nódulos : G= grande; M= mediano; P= pequeño Ndpd / Pt = Nº de nódulos ponderados por planta. Incremento de peso seco: Ps - ct (mg)= Peso seco de la muestra - peso seco del control - = sin nódulos
Cuadro 4. Niveles de resistencia a varios antibióticos de cepas de Bradyrhizobium sp y especies de Rhizobium.
Antibiótico | Rif 10-100 mg/ml |
Cl 5-100 mg/ml |
Sm 5-50 mg/ml |
Km 10-80 mg/ml |
Van 5-35 mg/ml |
Sp 5-40 mg/ml |
Ap 5-50 mg/ml |
Cepa | |||||||
Bradyrhizobium sp | |||||||
105 | - | 5-10 | - | - | - | 5-40 | 5-10 |
110 | - | 5-10 | - | - | - | 5-40 | - |
2004 | - | - | - | - | - | 5-40 | - |
2006 | 10-20 | 5-10 | 5-50 | 10-80 | 5-35 | 5-40 | 5-50 |
2007 | 10-100 | 5-100 | 5-50 | 10-80 | 5-35 | 5-40 | 5-50 |
2012 | 20 | 5-100 | 5-12 | NP* | 5-35 | 5-40 | 5-50 |
3010 | 10 | 5-10 | 5-12 | - | - | 5-40 | NP |
4017 | - | - | NP | NP | - | 5 | NP |
5004 | 10-100 | 5-50 | 5-25 | - | 5-35 | 5-10 | 5-10 |
5017 | - | 5-100 | 5-25 | - | 5-35 | 5-40 | 5-50 |
R. meliloti | |||||||
L530 | 10-30 | 5-50 | 5-50 | 25 | 5-35 | 5-40 | 5-50 |
B19 | - | 5-100 | 5-50 | - | 5-35 | 5-40 | 25 |
R. trifolii | |||||||
A16 | - | 5-100 | 5-50 | 25 | 5-35 | 5-40 | 5-50 |
R. cowpea | |||||||
2453 | 20 | 5-25 | 5-12 | - | - | 40 | 5-10 |
* No probado = NP*
- Ningun crecimiento; Sensibilidad.
A las cepas de R. meliloti L530 y B19, R. trifolii A16 y R. cowpea 2453, se les estudió su patrón de resistencia /sensibilidad a antibióticos para tener una referencia de la posible relación entre infectividad, efectividad, resistencia a antibióticos y su perfil de plásmidos en cepas de Rhizobium spp. L530 presentó resistencia a todos los antibióticos, B19 es sensible a rifampicina y kanamicina; A16 se parece a L530, pero es sensible a rifampicina.
Estos resultados son comparables a los observados en poblaciones de R. phaseoli (1) y de R. trifolii (14), donde cada cepa tiene un patrón de resistencia a antibióticos muy particular, indicando que son una población muy heterogénea. Beynon y Josey (1) observaron 56 tipos de patrones de resistencia en 259 cepas estudiadas.
Según Hartman (10) el espectro de resistencia intrínseca a antibióticos pone de manifiesto la gran diversidad genética en las poblaciones de Rhizobium, por lo tanto patrones de resistencia a antibióticos en cepas silvestres de Bradyrhizoium sp. permiten separarlas entre sí y hacer un seguimiento fácil cuando son inoculadas en el campo.
Formación de pigmento. La formación de pigmento pardo durante el envejecimiento se observa en las cepas 5, 105, 2006, 2007 y 4018 (cuadro 1). Este pigmento fue formado en placas de Petri con MR o TY y en tubos con MR. Las cepas 2005 y 2006 formaron pigmento en medios con antibióticos. Dada la formación constante de pigmento en estas cepas, esta característica puede ser usada como marcador genético. Numerosas especies bacterianas producen pigmentos como carotenoides y antocianinas cuyos determinantes genéticos se encuentran en plásmidos (2). En Erwinia herbicola (5) la presencia de pigmentos está relacionada con un plásmido de 500 kb; en R. phaseoli (2) y R. leguminosarum (12) genes requeridos para la síntesis de melanina también lo son para la fijación de nitrógeno.
Perfil de plásmidos. La evidencia física de la presencia de plásmidos en 17 cepas de Bradyrhizobium sp. es mostrada en las figuras 1, 2 y 3. Rhizobium meliloti 41, L530 y Agrobacterium tumefaciens C58 poseen plásmidos de alto peso molecular. De 17 cepas estudiadas 10 poseen plásmidos. En el género Rhizobium los genes simbióticos se encuentran en plásmidos (pSym) (4, 10, 19, 21). Para el caso de las funciones simbióticas en el género Bradyrhizobium no se puede asegurar que éstas se encuentren relacionadas con la presencia de material extracromosómico.
En B. japonicum los genes simbióticos están en los cromosoma de manera que la presencia de plásmidos de alto peso molecular en las cepas 107, 105, 103, 118, 120, 2004, 2006, 2007, 2012 y 4008 no se puede relacionar con su capacidad de nodulación y de fijación (20, 24, 26). La cepa 103 presenta un plásmido de peso molecular más bajo (figura 1). Estos plásmidos puden tener las mismas funciones que en Azospirillum (7) y Enterobacter (15).
Figura 1. Electroforésis en gel de agarosa de aislados de las cepas de R. meliloti: (a) 41 y (b) L530; (j) A. tumefaciens C58; Bradyrhizobium sp.; (c) 5; (d) 107; (e) 102; (f) 105; (g) 103; (h) 118; (i) 120. Las flechas indican la posición de los plásmidos de las cepas de R. meliloti 41 y L530 y A. tumefaciens C58.
Figura 2. Electroforésis en gel de agarosa de aislados de las cepas de R. meliloti: (a) 41 y (b) L530; (k) A.. tumefaciens; Bradyrhizobium sp.; (c) 505; (d) 505; (e) 508; (f) 2004; (g) 2006; (h) 2007; (i) 2011; (j) 2012. Las flechas indican la posición de los plásmidos de las cepas de R. meliloti 41 y L530 y A. tumefaciens C58.
Figura 3. Electroforésis en gel de agarosa de aislados de las cepas de R. meliloti: (a) 41 y (b) L530; (k) A.. tumefaciens C58 (f); Bradyrhizobium sp; (c) 4008; (d) 4013 y (e) 4018. Las flechas indican la posición de los plásmidos de las cepas de R. meliloti 41 y L530 y A.. tumefaciens C58.
La presencia de plásmidos de alto peso molecular (aproximadamente 200 MD) se puede observar en cepas nodulantes y no nodulantes lo cual confirma una vez más que en el género Bradyrhizobium los determinantes genéticos para la nodulación y la fijación de nitrógeno no se encuentran en plásmidos como el género Rhizobium.
Las cepas 102, 103, 105, 107, 118 y 120 son todas aisladas de nódulos de una misma planta de L mutabilis y a excepción de 102 todas presentan plásmidos. Igual sucede con las cepas 2004, 2006, 2007, 2011 y 2012 aislados de una planta de L. meridanus, donde solo 2011 no presenta plásmidos. Lo anterior indica que posiblemente la población de bradyrizobios que ha infectado a una sola planta, puede originarse de una población base que se ha multiplicado y puede existir pérdidas de material genético plasmídico en algunos de sus miembros.
En las cepas 2006, 2007 y 2012 resistentes a rifampicina también se evidenció la presencia de plásmidos de alto peso molecular (figuras 1 y 2) posiblemente relacionados con la resistencia a rifampicina; en las cepas 3010 y 5004 no se determinó presencia de plásmidos.
Plásmidos de alto peso molecular también están presentes en las cepas de R. meliloti L530 (4,5) y B19, R. trifolii A16 y R. cowpea 2453 (trabajo no publicado) las cuales son infectivas , efectivas y con resistencia a varios antibióticos. Estos plásmidos están relacionados con la capacidad de fijación (2, 4, 15, 22, 23) y posiblemente con la resistencia a antibióticos como sucede en R. trifolii (8).
El pigmento marrón se observó en las cuatro cepas con plásmidos (105, 2006, 2007 y 4018) y en la 5 que posee plásmidos. Esto contradice lo encontrado en otras especies de bacterias donde la formación de melanina está codificada en un plásmido; sin embargo, es posible que también haya información codificada para la formación de pigmento en otro componente del genoma bacteriano ya que la cepa 5 fue varias veces analizada para determinar la presencia de plásmido y siempre fue negativo el resultado, sin embargo, siempre formó pigmento marrón.
En estudios de poblaciones naturales de Rhizobium y Bradyrhizobium, Hartmann (11) determinó que son heterogéneas; su diversidad utilizando diferentes métodos de caracterización es importante sin que el nivel de diversidad obtenida por los diferente métodos sean siempre correlacionado, Este autor confirma que el estudio de cualquier característica en poblaciones de Rhizobium y Bradyrhizobium pone en evidencia la diversidad de fenotipos simbióticos.
Estos resultados nos llevan a concluir que la población de Bradyrhizobium sp. aislada de nódulos de L. meridanus y L. mutabilis provenientes del páramo merideño, presenta gran diversidad en su capacidad de nodulación, eficiencia, formación de pigmento y presencia de plásmidos de alto peso molecular. Tal diversidad permite seleccionar las cepas más eficientes y con marcadores naturales para ser usadas como inoculantes en el campo.
El estudio de cepas de Bradyhrizobium spp. aisladas de L. meridanus y L. mutabilis, ha mostrado que son una población heterogénea con diferencias en su capacidad de nodulación, fijación de nitrógeno, resistencia a antibióticos, formación de pigmentos y perfil de plásmidos. Las cepas 105, 505, 120, 2007, 5017 y 2006, eficientes en la fijación de nitrógeno, medida como incorporación de materia seca, pueden ser usadas como inoculantes en campo y su seguimiento puede realizarse con marcadores como la resistencia a antibióticos y su perfil de plásmidos.
Estos resultados indican que la población de Bradyhrizobium spp. aislada de nódulos de L. meridanus y L mutabilis provenientes del páramo merideño, presenta gran diversidad en su capacidad de nodulación, eficiencia, formación de pigmento y presencia de plásmidos de alto peso modecular. Tal diversidad permite seleccionar las cepas más eficientes y con marcadores naturales para ser usadas como inoculantes en el campo.
Al Dr. Manuel Dagert por su colaboración en la visualización de los plásmidos. A la Sra. Beatriz Urrecheaga por la preparación de los medios de cultivo y al Sr. Sócrates Pérez por la reproducción del material fotográfico.
1. Beynon, J. L. and D. P. Josey. 1980. Demostration of heterogeneity in a natural population of Rhizobium phaseoli using variation in intrinsic antibiotic resistence. J. Gen. Microbiol. 118: 437 -442.
2. Bourthakar, D., J. W. Lamb, and A. W. Johnston. 1987. Identificaction of ten classes of Rhizobium phaseoli gene required for melanin synthesis one of which is required for nitrogen fixation and activities and transcription of the other. Mol. Gen. Genet. 207: 156-160.
3. David, M., M. Vielma and J. S. Julliot. 1983. Introduction on IncQ- plasmid into Rhizobium meliloti. Isolation of a host-range mutant of RSF1010 plasmid. FEMS Microbiology Letters 16: 335 -341.
4. Denarié, J., P. Boistard and F. CasseDelbart 1981. Indigenous plasmids of Rhizobium. In: International Review of Cytology . Supplement 13. Academis Press Inc. 225-245.
5. Ganlotti. B. V. and S. V. Beer. l982. Plasmid borne determinants of pigmentation and thyamine prototrophy in Erwinia herbicola. J. Bacteriol. . 151:1627-29.
6. Geniaux, E. and N. Amarger. 1993. Diversity and stability of plasmid transfer in isolated from a single field population of Rhizobium leguminosarum bv. Viciae. FEMS Microbiol. Ecology 102: 251 - 260.
7. Givadan, A. and R. Bally. 1991. Similarities between large plasmid of Azospirillum lipoferum. FEMS Microbiol. Letters 78: 245-252.
8. Glynn, P., P. Higgins, A. S. Squatini, and F. O'Hara. 1985. Strain identification in Rhizobium trifolii using DNA restriction analysis, plasmid DNA profiles and intrinsic antibiotic resistance. FEMS Microbiol. Letters 30: 1777-1782.
9. Gross, R. 1982. Chemical characterization of the plants and the seeds. En: Gross, R., and E. S. Bunting (eds.). Agricultural and Nutricional Aspects of Lupinus. 570- 583. Deutsche Gesellchafl für Techische Zusammenorbert (GTZ) GmbH. Eschborn, 1982.
10. Hartmann, A. 1984. Ëtude ecollogiue de Rhizobium meliloti: composition et distribution d'une population naturelle. Tesis Doctor Tercer Ciclo. Universidad de Dijón. Francia. 52 p.
11. Hartmann, A. 1989. Caractérisation du génoma de Rhizobium et Bradyrhizobium au niveau moléculaire et son utilisation en écologie microbienne: diversité des populations naturalles et potentiel de transfert de plasmides. Tesis Doctor.. Universidad de Bourgone. Francia. . 145 p.
12. Hawkins, F. K. L., C. Kennedy, and A. W. Johnston. l991. A Rhizobium leguminosarum gene required for symbiotic nitrogen fixation, melanin synthesis and normal growth on certain growth media. J. of Microb. 137: 1721-1728.
13. Jordan, D. C. 1984. Rhizobiaceae. In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Edited by N.R. Krieg, Baltimore, Maryland. USA .pp 234-256.
14. Josey, P., J. L. Beynon, A. W. B. Johnston, and J. E. Beringer.1979. Strain identification in Rhizobium using intrinsic antibiotic resistence. J. Appl. Bacteriol. 46: 453-350.
15. Klinmüller. W..1991. Plasmid transfer in natural soil: a case by study with nitrogen fixing Enterobacter. FEMS Microbiol. Ecology. 85:107-116.
16. Lamb., J. W., J. A. Bownie, and A. M. B. Jonston. 1985. Cloning of Rhizobium phaseoli and homology to R. leguminosarum nod DNA. Gene 34: 235- 241.
17. Maniatis, T., E. F. Fristch, and J. Sambrook. 1982. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 363-369
18. Martínez- Romero, E and J. Caballero-Mellado. l996. Rhizobium phylogenies and bacterial genetic diversity. Critical Reviews in Plant Science 15(2): 113-140.
19. Meöne-Loccoz, Y. and R. W. Weaver.1995. Plasmid and saprophytic growth of Rhizobium leguminosarum bv. trifolii W14-2 in soil. FEMS Microbiol. Ecology 18:139-144.
20. Noti, J. D., B. Dudas, and A. A. Szaly.1985. Isolation and characterization of noduling genes from Brazdyrhizobium sp (Vigna) strains IRC78. Proc. Natl. Acad. Sci, USA 82: 7379 - 7383.
21. Ollero, F., M. R. Espuny, J. Perez-Silva, and R. A. Bellogin 1991 Behaviour of sym plasmid from Rhizobium `hedysary' in different Rhizobium species. FEMS Microbiol. Ecology. 86: 131-138.
22. Roberts, V. M., P. Russel and A. Atherly.1982. Nitrogen fixation (nif) gens and large plasmids of Rhizobium japonicum. J. of Bacteriology 152: 928 - 931.
23. Rukvum, G. B. and F. M. Ausbel. 1980. Inter-species homology of nitroge- nase gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 77:191-95.
24. Russel P. G. K. K. Shell L. J. Nelson K. M. Halverson, K.M. Sirotkin, and G. Stacey ( 1985). Isolation and characterization of the DNA region enconding nodulation function in Bradyrhizobium japonicum. J. of Bacteriol. 164:1301-13008.
25. Schöenberger, H., O. Sam, H. D. Cremer, I. Elmadfan and R. Gross. 1982. . Protein quality of Lupinus mutabilis and its influence trougth preparations and suplementation. En: Gross R., and E. S. Bünting (eds.) Agricultural and nutricional aspects of Lupinus. 1982.pp. 694 - 705. Eschborn F. R. G.
26. So, Jae-Sean. A. L. M. Hodyson, R. Haugland, M. Leavitt, Z. Banfalvi. 1987. Transposon induced symbiotic mutants of Bradyrhizobium japonicum Isolation of the gene region essentials for nodulation. Mol. Gen. Genet. 207:15-23.
27. Vareschi, Volkmar. 1970. Flora de Páramos de Venezuela. Universidad de Los Andes. Ediciones del Rectorado. Mérida, Venezuela pp. 141-143.
28. Van Berkium, P., D. Beyene, G. Bao, T. A. Campbell and B. D. Eeardly. 1998. Rhizobium mongolense sp. Nov. is one of the three rhizobial genotypes identified which nodulate and form nitrogen-fixing symbioses with Medicago ruthenica (L.) Ledebour, International Journal of Systematic Bacteriology 48:13 -22.
29. Vincent, J. M. 1970. A manual for the practical study of root nodule bacteria. International Biological Programme handbook. Vol. 15. Oxford. Blackwell Scientific Publishing. 200 p.