Rev. Fac. Agron. (LUZ). 1999, 16: 509-516

Actividad metabólica de cepas de Trichoderma spp para el control de hongos fitopatógenos del suelo.

Metabolic activity of Trichoderma spp. isolates for a control of soilborne phytopathogenic fungi.

Recibido el 27-05-1999 l Aceptado el 12-09-1999
1. Departamento de Microbiología, Laboratorio de Bacteriología, Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal , Calle 110 # 504 esq. 5ta F, Playa. E-mail: [email protected]

Resumen

Entre los hongos utilizados para el biocontrol de patógenos fúngicos de suelo, varias especies de Trichoderma han sido merecedoras de una mayor atención, su actividad resulta en una combinación de micoparasitismo y producción de metabolitos. Se estudió la actividad metabólica de cuatro aislamientos de Trichoderma spp. definidos como promisorios para el control de diversos patógenos del suelo, entre ellos Phytophthora nicotianae, Phytophthora capsici, Rhyzoctonia solani y Pythium spp. Los aislamientos A-34 (Trichoderma harzianum), A-86 (Trichoderma viride), A-53 (Sección Trichoderma) y PR-617 (Sección Longibrachiatum) producen metabolitos no volátiles con actividad antifúngica que reducen el crecimiento de Phytophthora nicotianae y Rhizoctonia solani en medio de cultivo enmendado con los filtrados a partir de cultivos líquidos donde fueron cultivadas las cepas antagónicas. La hidrólisis del almidón, gelatina, carboxymetilcelulosa, quitina y caseina indicó la presencia en los filtrados de las enzímas líticas: carboxymetilcelulasa, quitinasa y b1,3 gluconasa, entre otras. El aislamiento A-86 emana además una lactona volátil con aroma a coco, probablemente 6 pentil alfa pirona que inhibe el crecimiento de P. nicotianae. Los metabolitos causan a nivel celular vacuolación, granulación, coagulación, desintegración y lísis.
Palabras clave: Trichoderma, metabolitos, biocontrol

Abstract

Introducción

El biocontrol actualmente ocupa un lugar importante dentro de las prácticas de manejo de enfermedades de las plantas causadas por los patógenos fúngicos del suelo, principalmente de los géneros Rhizoctonia, Sclerotium, Pythium, Phytophthora y Fusarium entre otros. Las especies de Trichoderma poseen buenas posibilidades en este sentido como hiperparásitos competitivos que producen metabolitos antifúngicos y enzimas hidrolíticas a los que se les atribuyen los cambios estructurales a nivel celular, tales como vacuolación, granulación, desintegración del citoplasma y lisis celular (1, 2, 8,10, 16).

En Cuba a partir de 1990 se efectuaron diversos estudios dirigidos al biocontrol de hongos del suelo patógenos al tabaco, hortalizas y otros cultivos con aislamientos de Trichoderma que fueron seleccionados "in vitro" por su elevada capacidad hiperparásita y posteriormente utilizados en forma de biopreparados para combatir Phytophthora nicotianae, Phytophthora capsici, Rhizoctonia solani y otros fitopatógenos en condiciones de campo (11,12).

El presente trabajo se realizó con el objetivo de conocer la presencia y participación de los metabolitos en la inhibición de los fitopatógenos que estas cepas de Trichoderma controlan.

Materiales y métodos

Los cuatro aislamientos de Trichoderma utilizados y sus especificidades se muestran en el cuadro 1. Para demostrar la presencia de metabolitos no volátiles, las cepas se cultivaron en los medios de cultivo líquidos papa-dextrosa (PD) y melaza-levadura torula (ML), este último empleado en la producción de biopreparados del hongo. Los frascos con 200 ml de los medios se inocularon con discos ( uno por frasco) de cultivos de 48 horas de crecimiento, la reproducción se efectuó de forma estática a temperatura entre 27-30ºC.

Diez días despues se tomaron muestras del líquido o filtrados obtenidos mediante filtración con papel que luego fueron, centrifugados a 15000 rpm, durante 20 min, y por último el sobrenadante fue pasado por el filtro milipor de 0,22 µm.

Cuadro 1. Especificaciones de los aislamientos de Trichoderma estudiados.

Los filtrados fueron mezclados con el medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA) en una proporción de 1:1. Se comparó el tamaño de las colonias de R. solani y Phytophthora nicotianae, cepas Rs-21 y 223 respectivamente, crecidas en el medio enmendado y en las placas que contenían PDA solamente.

La actividad hidrolizante de los filtrados fue comprobada en medios de cultivo con almidón, gelatina, carboxymetilcelulosa, quitina y caseína. El líquido fue depositado en los orificios a razón de 200µl y se registró la presencia de zona hidrolizada alrededor, una vez revelada la reacción con solución de yodo al 1%.

La producción de metabolítos volátiles se estudió cultivando la cepa antagónica en la base de la placa Petri sobre el medio PDA, y en la tapa, el hongo fitopatógeno, en este caso se empleó la cepa 223 de P. nicotianae. Las placas fueron selladas con cinta plástica y el efecto de los volátiles se comprobó por la comparación del diámetro de las colonias del patógeno con sus testigos a los 3 y 7 días del montaje.

La degradación de la celulosa por las cepas se determinó en tiras de papel de filtro introducidas en un medio líquido de sales, distribuido en tubos. A los 15 y 20 días de incubación se comprobó la desintegración del papel con respecto al testigo no inoculado. Para determinar la presencia de enzimas celulíticas, las cepas se cultivaron en el medio de sales al que se le añadió celulosa más xylosa, como precursor de la síntesis de las enzimas, ambos al 1%. Luego de 21 días de incubación, se separó el sobrenadante y una vez filtrado se depositó en los orificios practicados en medio agarizado con carboxymetilcelulosa al 1%, además se evaluó la existencia de las otras enzimas líticas anteriormente mencionadas.

Se comprobó el efecto sobre el micelio fúngico de los metabolitos producidos por las cepas A-53, A-34 y PR-617. Para esto se tomaron fragmentos del micelio de una colonia de P. nicotianae de 7 días de crecida en PDA que se colocaron en tubos con 1 ml de los filtrados, luego de 3 días de incubación a 27ºC se hicieron observaciones en el microscopio óptico. El testigo fue montado con agua destilada estéril.

Se realizó un análisis de varianza utilizando el sistema STATITCF para un 5% de probabilidad de error.

Resultados y discusión

Los metabolitos volátiles producidos por las cepas de Trichoderma provocaron un desarrollo micelial menos denso y reducción del tamaño de la colonia de P. nicotianae en comparación con el testigo. La cepa A-86 produjo un efecto fungistático notable sobre el hongo fitopatógeno (cuadro 2).

Otros autores (4,13) han mencionado, como parte del mecanismo de biocontrol, el efecto biológico fungistático de sustancias volátiles emanadas por sistemas vivos incluyendo a Trichoderma, aunque en la mayoría de los casos no se especifica la naturaleza de los mismos. Bengston et al.(1) determinaron la presencia de una lactona volátil, 6 -pentyl alfa pirona, con fragancia a coco, como metabolito principal de Trichoderma viride. La cepa A-86 perteneciente a esta especie es caracterizada por el mismo aroma, que sugiere la presencia del mencionado metabolito o de otro con características similares.

Los filtrados de los aislamientos estudiados, mezclados con el medio de cultivo, limitaron el crecimiento de las especies fitopatógenas por la presencia de metabolitos biológicamente activos (cuadro 3).

Igualmente hidrolizaron la gelatina, caseína, leche, carboxymetilcelulosa (CMC) y la quitína, debido a la existencia de enzimas líticas de carácter proteolítico y celulítico, además de la enzima quitinasa. Los filtrados obtenidos a partir del medio basal enmendado con xylosa y celulosa tuvieron marcada actividad lítica sobre la CMC, no así sobre las proteínas, lo cual puede atribuírse a una mayor producción de enzimas del complejo celulasa en este medio. Estos filtrados también hidrolizaron la quitina y el almidón, esto último señala la existencia de enzimas que atacan enlaces glucosídicos (cuadro 4).

Cuadro 2. Efecto de los metabolitos volátiles producidos por las cepas de Trichoderma contra P. nicotianae

CV= 5,6%. CV= 2,4%. CV=4,7%. CV= 2,6%. DE= 1,23. DE= 0,95. CV= 0,89. DE= 0,88.

Todas las cepas objeto de estudio colonizaron el papel de filtro y provocaron su desintegración a los 15-20 días. En este sentido, Gomez et al.(6)determinaron que cepas de T. viride y T. harzianum poseen actividad carboxymetylcelulasa, b-glucosidasa, xylanasa y b-xylosidasa comparable con la de Trichoderma reesei respecto a la producción de celulasa en papel de filtro. La cepa PR-617 mostró poca actividad en esta prueba, sin embargo, en el filtrado a partir de la misma se detectó la presencia de enzimas celulíticas, posiblemente estimuladas por el sustrato específico empleado. La especie T. longibrachiatum, con la cual es afín dicha cepa, no induce normalmente niveles notables de esta enzima y necesita estimulantes para la producción enzimática (9).

Cuadro 3. Efecto de los metabolitos no volátiles sobre P. nicotianae y R. solani

ML: medio melasa - levadura , PD: medio papa dextrosa.

Cuadro 4. Actividad lítica de los filtrados sobre diferentes substratos.

C: Medio basal enmendado con celulosa + xylosa (1%). S: Medio basal enmendado con xylosa (1%). ML: Medio melaza-levadura torula. PD: Medio papa - dextrosa.

El efecto directo de los metabolitos de los aislamientos A-34, A-53 y PR-617 sobre el micelio de P.nicotianae se expresó en deformaciones del micelio, desplazamiento del contenido citoplasmático, afinamiento y lisis de las paredes celulares, resultados que ofrecen respuesta al origen de los cambios estructurales microscópicos que ocurren en el contacto entre el patógeno y las cepas de Trichoderma y corroboran los obtenidos anteriormente por Cherif y Benhamou (2).

La producción activa de metabolitos extracelulares por las especies de Trichoderma y su importancia en el biocontrol ha sido señaladas en numerosos estudios (3, 4, 6, 7, 8, 10), la manipulación genética de las proteinasas, incluso es una forma promisoria para incrementar la actividad biológica de T.harzianum (4, 5). La detección de quitinasa sobre substrato específico indica la biosíntesis de esta enzima por las cepas objeto de estudio. Cherif y Benhamou (2) y Uloha y Peberdy (16) informaron la existencia de quitinasa entre los metabolitos líticos de Trichoderma y sugirieron su importancia en el biocontrol como enzima micolítica. La combinación incluso de b 1,3 glucanasa y quitinasa es más efectiva en la inhibición de los hongos (8, 10, 17).

Los aislamientos A-34, A-53, A-86 y PR-617 se emplean en forma de biopreparados para combatir los hongos del suelo en tabaco, hortalizas, granos y otros cultivos con una aceptación muy favorable por el agricultor. Parte de la efectividad de los mismos se puede atribuir a la producción de los metabolitos y su efecto sobre los patógenos, tal y como lo demuestran los resultados anteriormente expuestos.

Conclusiones

El crecimiento de Phytophthora nicotianae y Rhizoctonia solani se puede reducir mediante metabolitos no volátiles con actividad antifúngica producidos por los aislamientos A-34 (Trichoderma herzianum), A-86 (Trichoderma viride), A-53 (Sección Trichoderma) y PR-617 (Sección longibrachiatum).

Se constató en los filtrados la presencia de enzimas líticas, carboxymetilcelulosa, quitinasa y b 1,3 gluconasa mediante la hidrólisis del almidón, gelatina, carboxymetilcelulosa, quinina y caseina.

El aislamiento A-86 emana una lactosa volátil, probablemente con una estructura química de 6 pentil alfa pirona que inhibe el crecimiento de P. Nicotianae.

Los metabolitos evaluados cau-san a nivel celular vacuolación, granulación, coagulación, desintegración y lisis.

Los aislamientos A-34, A-53, A-86 y PR-617 se pueden emplear como biopreparados que producen metabolitos capaces de combatir hongos del suelo en tabaco, hortalizas, granos y otros cultivos con aceptación muy favorable por parte del agricultor.

Literatura citada

1. Bengston, G., K.W. Boeddeker, H.P. Hanseen and I. Urbasch.1992. Recovery of 6-pentyl- alpha pyrone from Trichoderma viride culture medium by pervaporation. Biotechnol. Tech. 6 (1): 23-26.

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