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Rev. Fac. Agron. (LUZ). 1998, 15:142-152
El análisis de Conglomerado para complementar el estudio de patrones
electroforéticos en Psidium spp.1
Cluster analysis for supplementing Psidium spp. electrophoretical pattern study
Recibido el 18-10-1996lAceptado el
16-06-1997
1. Proyecto confinanciado por CONICIT No SI-2609 y CONDES No 1037-94.
2. Facultad de Agronomía. La Universidad del Zulia.
3. Departamento de Agronomía. Facultad de Agronomía. La Universidad del Zulia. Apartado
15205. Maracaibo, ZU 4005, Venezuela. E-mail: anava@europa.ica.luz.ve
4. Departamento de Estadística. Facultad de Agronomía. La Universidad del Zulia.
N. Albany2, J. Vilchez2, A. Nava3, M. González2 y C. Castro de Rincón4
Resumen
Palabras claves: conglomerados, electroforesis, guayaba
Abstract
T
Key words: cluster, electrophoresis, guava.
Introducción
El análisis isoenzimático ha sido comúnmente usado en agronomía, sistemática y estudios evolutivos (18) y permite estudiar en forma indirecta el genoma de una determinada especie (7), ya que de éste se genera un patrón de bandeo que corresponde al fenotipo electroforético de la enzima estudiada (4), basado en la variabilidad existente en relación al peso molecular, carga eléctrica y mantenimiento de su actividad catalítica, permitiendo la confección de patrones isoenzimáticos (1).
El parentesco genético puede ser estimado por pedigrí, heterosis, morfología, proteínas e isoenzimas (8) por tanto, es factible caracterizar especies a través del análisis isoenzimático. Sin embargo son muy pocas las investigaciones que utilizan un análisis estadístico para establecer parentescos genéticos derivados de análisis isoenzimáticos. No obstante el análisis de conglomerado aglomerativo está siendo usado cada vez más en la investigación sobre mejoramiento genético para determinar el parentesco entre líneas consanguíneas, híbridos o variedades (9). Hamman (6), establece que las técnicas de análisis multivariado facilitan la interpretación y visualización de la medición fenotípica.
El conglomerado simplemente definido consiste en agrupar unidades taxonómicas operacionales semejantes, que pueden estar distribuidas dentro del espacio fenético en forma regular o al azar (16). El resultado del análisis de conglomerado es una matriz de disimilitud construida en base a un coeficiente de distancia el cual puede ser expresado en forma porcentual (9), cuya representación espacial es lo que se conoce como fenograma o dendograma y puede ser interpretado en forma intuitiva.
Entre los coeficientes más usados para un análisis de conglomerado se encuentran el coeficiente de similitud de Dice y el de Jaccard. Este último es equivalente al coeficiente de Gower (9) y se caracteriza por no considerar los apareamientos negativos, siendo el más simple entre los de su clase (16). Los coeficientes de similitud y distancia son estimadores cuantitativos que describen el grado de asociación o semejanza entre los elementos comparados, expresado en valor numérico, entre 0 y 1, o en porcentaje (0 y 100%, respectivamente).
El análisis de sistemas isoenzimáticos basado sólo en el estudio del zimograma resulta poco eficiente, ya que éste se fundamenta en el análisis visual del patrón de bandeo de la enzima estudiada, el cual se complica al aumentar el número de bandas y/o muestras; debido a las limitaciones visuales. Sin embargo, complementar el estudio del zimograma con el dendograma (conglomerado) permite realizar un análisis más completo y eficiente de los sistemas isoenzimáticos.
El objetivo de este trabajo fue demostrar la aplicabilidad del análisis por conglomerado, para diferenciar las especies de Psidium guajava L. y Psidium friedrichsthalianum (Berg) Niedz, basado en los patrones isoenzimáticos de a -esterasa, b -esterasa, Fosfatasa ácida y peroxidasa.
Materiales y métodos
Electroforésis. Las muestras de las especies Psidium guajava L. y Psidium friedrichsthalianum (Berg) Niedz, fueron tomadas del Centro Frutícola del estado. Zulia, seleccionando hojas completamente expandidas del 3er, 4to y 5to nudo, las cuales se maceraron con las soluciones extractoras: Tris-glicina pH 8,0, Tris-HCl pH 7,5 y González de León, conformándose de esta manera un total de 18 tratamientos (cuadro 1). Los protocolos para electroforésis y tinción de las isoenzimas a -esterasa, b -esterasa, fosfatasa ácida y peroxidasa han sido descritos se realizaron por triplicado para cada tratamiento. (2, 10, 14).
Análisis estadístico. Los patrones isoenzimáticos de a -esterasa, b -esterasa, fosfatasa ácida y peroxidasa fueron representados en papel (zimogramas) utilizando la distancia promedio (cm) de tres observaciones de la(s) banda(s) de cada unidad taxonómica operacional (UTO’S) o tratamiento, medida desde el borde inferior del carril hasta el centro de la(s) misma(s) y ponderadas a una distancia de gel predeterminada (7 cm), descartando observaciones fuera de tipo.
Cuadro 1. Descripción de los Tratamientos
TRATAMIENTOS |
ESPECIES | POSICION DE HOJA |
SOLUCIONES EXTRACTORAS |
T1 |
P. guajava | N3 |
González de León |
T2 |
P. guajava | N3 |
Tris-Glicina |
T3 |
P. guajava | N3 |
Tris-HCl |
T4 |
P. guajava | N4 |
González de León |
T5 |
P. guajava | N4 |
Tris-Glicina |
T6 |
P. guajava | N4 |
Tris-HCl |
T7 |
P. guajava | N5 |
González de León |
T8 |
P. guajava | N5 |
Tris-Glicina |
T9 |
P. guajava | N5 |
Tris-HCl |
T10 |
P. friedrichsthalianum | N3 |
González de León |
T11 |
P. friedrichsthalianum | N3 |
Tris-Glicina |
T12 |
P. friedrichsthalianum | N3 |
Tris-HCl |
T13 |
P. friedrichsthalianum | N4 |
González de León |
T14 |
P. friedrichsthalianum | N4 |
Tris-Glicina |
T15 |
P. friedrichsthalianum | N4 |
Tris-HCl |
T16 |
P. friedrichsthalianum | N5 |
González de León |
T17 |
P. friedrichsthalianum | N5 |
Tris-Glicina |
T18 |
P. friedrichsthalianum | N5 |
Tris-HCl |
T= tratamiento P= Psidium N= nudo de la rama.
El análisis de conglomerado se realizó de la siguiente manera:
1. Se construyó un gráfico para cada isoenzima con la(s) distancia(s) promedio recorrida por la(s) banda(s) vs. tratamiento, excluyendo aquellos tratamientos que no mostraron bandas en el revelado de los geles.
2. Se trazó una línea recta y paralela al eje de las abcisas (tratamientos), uniendo las bandas de los distintos tratamientos con distancia semejante.
3. Se enumeró cada línea trazada en el punto 2, en forma ascendente, comenzando por la más cercana al eje de las abcisas hasta la última línea formada.
4. Se construyó una matriz, ubicando en la primera columna en orden creciente el número de líneas paralelas generadas en el gráfico (punto 3) y en la primera fila o "renglón", los tratamientos. Esta matriz se alimentó con código binario para indicar presencia (1) y ausencia (0) de banda(s) para cada tratamiento; sobre cada línea paralela del gráfico.
5. Partiendo de la matriz binaria se calculó el coeficiente de similitud de Jaccard (Sj) entre pares de tratamientos a comparar, a través de la siguiente fórmula:
Donde:
Sj: Coeficiente de similitud de Jaccard entre dos tratamientos a comparar.
No B.C: Número de bandas comunes entre los tratamientos a comparar.
No B.N.C: Número de bandas no comunes entre los tratamientos a comparar.
6. Se calculó el coeficiente de disimilitud o distancia (D) utilizando la siguiente fórmula:
Donde:
D: Coeficiente de disimilitud.
Sj: Coeficiente de similitud de Jaccard entre pares de tratamientos a comparar.
7. Se construyó una nueva matriz denominada primera matriz de distancia (PMD), en la cual se ubicaron en la primera columna y primera fila todos los tratamientos que se compararon. Se alimentó PMD con los coeficientes de distancia entre pares de tratamientos comparados.
8. Se buscó el menor coeficiente de distancia y se construyó una segunda matriz de distancia (SMD), uniendo los tratamientos involucrados con el menor coeficiente de distancia. La SMD se alimenta de los coeficientes de distancia calculados en PMD y recalculando (promedio) solo aquellos relacionados con los tratamientos unidos por el menor coeficiente de distancia.
9. Se repitió el punto 8 hasta que los coeficientes de distancia que relacionaban los tratamientos o grupos de tratamientos fuesen 1, o bien, todos los tratamientos comparados formaran un solo grupo a una distancia determinada.
10. Con los coeficientes de distancia que unieron los tratamientos comparados en cada matriz, se elaboró el fenograma, colocando en el eje de las ordenadas el valor del coeficiente de distancia y en el eje de las abcisas los tratamientos comparados.
Este procedimiento puede realizarse a través del Proc Cluster del SAS (15) o del programa NTSYS (11).
Resultados y discusión
Los resultados se presentan en figuras, ubicando en la parte superior el dendograma y en el inferior el zimograma para cada sitema isoenzimático.
a -esterasa. para esta isoenzima se formaron cinco grupos bien definidos (figura 1). El primer grupo, conformado por T10, T11, T12, T13 y T14 agrupados a una distancia cero, indicando 100% de similitud, todos los tratamientos anteriormente señalados involucraron a P. friedrichsthalianum como especie estudiada.
Figura 1. Dendograma y zimograma del sistema isoenzimático a -esterasa.
En el segundo grupo se agruparon T5, T6 y T8 a una distancia de 0,667 o 33,3% de similitud, incluye los tratamientos que mostraron en el zimograma dos bandas.
El tercero, cuarto y quinto grupos (T4 y T7; T2 y T3 ; T1 y T9, respectivamente) se asociaron independientemente a una distancia cero, indicando 100% de similitud. Los pares de tratamientos de cada grupo mostraron una banda con el punto medio ubicado en la misma posición dentro del zimograma.
El segundo, tercero, cuarto y quinto grupo, asociaron todos los tratamientos relacionados con la especie P. guajava y la diferencia entre ellos se basa en la posición relativa y número de bandas, generada por otros factores involucrados como buffers y posición de la hoja.
b -esterasa. En el dendograma se observa la formación de un primer grupo conformado por T10, T11, T13, T14, T16 y T18 agrupados a una distancia de 0 o 100% de similitud, tal como se observa en el zimograma, donde cada tratamiento mostró una banda con el punto medio ubicado en la misma posición (figura 2). Este grupo de tratamientos involucró como especie estudiada a P. friedrichsthalianum.
El segundo grupo (T6(T8(T5(T3,T4)))) asocia en un primer nivel los tratamientos 3 y 4 a una distancia cero, indicando 100% de similitud, en el zimograma se observa un mismo patrón de bandeo, posteriormente T5 se une a T3 y T4 a una distancia de 0,50; lo que indica 50 % de similitud. Al grupo (T5(T3, T4)) se une el T8 a una distancia de 0,584 indicando 41,6 % de similitud. A este grupo se asocia el T6 a una distancia de 0,917 indicando 8,3 % de similitud. Los tratamientos T6, T8 y T5 en el zimograma muestran dos bandas, siendo semejante la ubicación de la banda inferior.
Finalmente aparecen en forma independiente en el dendograma T1, T2, T7 y T9, es decir, son 100 % distintos, en el zimograma muestran una única banda catódica en ubicaciones diferentes.
Fosfatasa ácida. El dendograma muestra la agrupación de (((T2, T5)T8)T6), uniéndose en un primer nivel T2 y T5 a una distancia de 0,667 con 33,3 % de similitud; siendo semejante la posición de la segunda banda aniónica (figura 3). Posteriormente a una distancia de 0,75 se une T8 al grupo anterior, con 25 % de similitud, presentando tres bandas en el zimograma, de las cuales dos coinciden en posición con T5. A una distancia de 0,875 se une al grupo ((T2, T5)T8) el T6 con 12,5 % de similitud, su zimograma presenta tres bandas coincidiendo el punto medio de la banda intermedia con la posición de la banda superior de T5.
El dendograma muestra la presencia de T17 como UTO independiente ya que no se asocia a ningún otro tratamiento, en el zimograma se observa una única banda. T17 involucra a P. friedrichsthalianum a diferencia de los otros tratamientos que presentan más de una banda e incluyen a la especie P. guajava.
Peroxidasa. El dendograma de la figura 4 señala tres grupos conformados de la siguiente manera: El primer grupo está formado por ((((T11, T12, T14) T13) T2) T3), uniéndose en un primer nivel T11, T12 y T14 a una distancia cero, indicando 100% de similitud, en el zimograma se observan dos bandas en cada tratamiento. En un segundo nivel se une T13 al grupo anterior a una distancia de 0,667 ó 33,3% de similitud. En un tercer nivel T2 se asocia al grupo ((T11, T12, T14) T13) a una distancia de 0,800 lo que indica 20% de similitud. Finalmente en un cuarto nivel se une T3 al grupo anterior (((T11, T12, T14) T13) T2) a una distancia de 0,834 indicando 16,6% de similitud. En el zimograma se observa a una distancia similar la banda más catódica de los tratamientos asociados. Todos los tratamientos de este grupo involucran a P friedrichsthalianum excepto T2 y T3.
Figura 2. Dendograma y zimograma del sistema isoenzimático b -esterasa.
El segundo grupo está conformado por (((T16, T18) T4, T15) T6) agrupándose en un primer nivel T16 y T18 a una distancia cero, indicando 100% de similitud, dado que ambos tratamientos presentan en el zimograma dos bandas en la misma posición. Posteriormente en un segundo nivel se une T4 y T15 a una distancia de 0,667 ó 33,3% de similitud con el grupo anterior. En un tercer nivel se asocia T6 al grupo ((T16, T18) T4, T15) a una distancia de 0,75 que indica un 25 % de similitud con el grupo. En el zimograma todos los tratamientos asociados presentaron dos bandas con similar recorrido excepto T6.
El grupo (((T16, T18) T4, T15) T6) se une al grupo (T7(T10(T17, T5))(T1(T9, T8))) a una distancia de 0,909 lo indica un 0,091 % de similitud entre ambos grupos.
Un tercer grupo formado por (T7(T10(T17, T5))(T1(T9, T8)))) se origina por unión en un primer nivel T9, T8 y T17, T5 unidos en forma independiente, a una distancia de cero o 100 % de similitud entre ellos; el zimograma muestra que T17, T5 y T9, T8 presentan dos bandas cada uno en posiciones iguales en el gel. En un segundo nivel se une a (T9, T8) el T1 a una distancia de 0,334 e indicando 66,6 % de similitud. Posteriormente en un tercer nivel se une a (T17, T5) el T10 a una distancia de 0,5 e indicando 50 % de similitud. En un cuarto nivel se unen los grupos (T10(T17, T5)) y (T1(T9, T8) a una distancia de 0,647; compartiendo un 35,3% de similitud entre ambos. En un quinto nivel se une T7 a el grupo formado anteriormente, a una distancia de 0,855 ó 1,45% de similitud. Según el zimograma los tratamientos de este grupo presentan dos bandas excepto T1, ubicándose la primera banda catódica en posición semejante. Todos los tratamientos de este grupo involucran a P. guajava excepto T10 y T17
Figura 3. Dendograma y zimograma del sistema isoenzimático fosfatasa ácida.
Finalmente éste grupo (T7(T10(T17, T5))(T1(T9, T8))) se une a (((((T11, T12, T14) T13) T2) T3), (((T16, T18) T4, T15) T6)) a un distancia de 0.960 señalando un 0,04% de similitud entre ambos.
La información generada por el análisis de conglomerados a través del dendograma permite agrupar unidades taxonómicas operacionales (UTO’S) o muestras según un criterio y objetivo definido (número y distancia de banda), facilitando el estudio de un gran número de UTO’S aleatorizadas dentro del gel. A su vez la información generada por el zimograma en cuanto a tamaño, grosor, forma e intensidad de la banda, complementan el estudio de los sistemas isoenzimáticos, ya que esta información puede ser determinante en la caracterización o diferenciación (10) de los elementos estudiados y no es representada en el dendograma.
Resultados comparables a los observados en este ensayo han sido obtenidos en otras especies (12, 13 y 17).
En este estudio se observaron diferentes patrones de bandeo para una misma especie, debido a otros factores involucrados como buffer y posición de hoja en cada tratamiento aplicado, como manifestación del polimorfismo dentro de una misma especie para un mismo sistema isoenzimático (1, 3, 5).
Figura 4. Dendograma y zimograma del sistema isoenzimático peroxidasa.
Conclusiones
El análisis estadístico por conglomerado constituye un método confiable y eficiente para realizar el estudio de polimorfismo enzimático y establecer nexos comparativos entre materiales vegetales distintos, porque disminuye el tiempo de análisis facilitando la interpretación de los grupos asociados. En este estudio sólo se utilizaron las distancias recorridas por las bandas para la formación de los grupos, por tanto no se excluye el uso del zimograma para el análisis isoenzimático.
Los dendogramas generados a partir de los patrones de bandeo (zimograma) de los sistemas isoenzimáticos a -esterasa, b -esterasa y fosfatasa ácida permiten diferenciar las especies Psidium guajava L. y Psidium friedrichsthalianum (Berg.) Niedz. Sin embargo, el sistema isoenzimático peroxidasa no permite establecer diferencias entre Psidium guajava L. y Psidium friedrichsthalianum (Berg.) Niedz, ya que el dendograma generado de su patrón de bandeo asoció dentro de un mismo grupo, tratamientos que involucran ambas especies.
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