Rev. Fac. Agron. (LUZ). 1999, 16: 495-508

Caracterización de cepas autóctonas de Bradyrhizobium sp. aisladas de Lupinus spp

Recibido el 06-04-1999 l Aceptado el 26-09-1999
Universidad de Los Andes, Fac. de Ciencias, Depto de Biología, Lab. de Cultivos in vitro, Núcleo Universitario La Hechicera, Mérida, 5101. Tel. 074-401293, Fax 74-401286. E-mail: mvielma1@ula.ciens.ve

Resúmen

Abstract

Bradyrhizobium sp. is a nitrogen fixer bacterium which forms nodules on roots of Lupinus genus. This leguminous plant is largely distributed on the Andean paramos, and some species like L.mutabilis possess a high proteic content. Great potencial as an inoculant is also found in Bradyrhizobium sp. For instance, we tried to characterize isolated strains of radical nodules on L. mutabilis and L. meridanus using the following criterious: nodulation capacity, incorporation of dry matter, antibiotics resistence, pigments formation, and presence of high molecular weight plasmids. Great variability of these characteristics on isolated strains of both Lupinus species was observed, confirming again the great diversity of the nitrogen fixer bacterium population. However, these specific characteristic may be used to select more efficient strains such as: 105, 120, 2005, 2006, 2007 and 5017, in order to run tests with them as inoculants in field crops.
Key words: nodules, nitrogen fixation, plasmids, antibiotic resistence.

Introducción

Bradyrhizobium sp. forma nódulos en el género Lupinus, el cual se encuentra ampliamente distribuido en el Páramo merideño, siendo L. meridanus Moritz la especie más representativa (27). Los granos de algunas especies de esta leguminosa son de gran contenido proteico siendo usados en regiones del altiplano andino como fuente proteica (9, 25). L. meridanus (especie autóctona) y L. mutabilis Sweet (especie foránea de gran potencial proteico) pueden ser cultivadas extensivamente como plantas pioneras para el enriquecimiento en nitrógeno de los suelos pobres en nutrientes del páramo andino.

En Venezuela no se han realizado aislamientos y caracterizaciones de cepas nativas competitivas de Bradyrhizobium sp. que puedan asegurar el éxito como inoculantes para la explotación de este sistema fijador de nitrógeno. En este trabajo fueron aisladas numerosas cepas de Bradyrhizobium sp. provenientes de nódulos de L. meridanus Moritz y L mutabilis Sweet. Hartman (10) propone hacer una descripción cuantitativa y cualitativa de las poblaciones bacterianas para determinar en que caso el componente bacteriano puede ser limitante para la simbiosis con la leguminosa.

El objetivo del trabajo fue aislar los bradyrizobios de nódulos de L. meridanus y L. mutabilis y determinar características fenotípicas que puedan servir para definir su eficiencia para ser usadas como inoculantes en cultivos en el campo. Por lo tanto, la caracterización fue realizada tomando en cuenta propiedades simbióticas como especificidad de huésped, infectividad en su huésped natural y eficiencia (10), resistencia a antibióticos (1, 14), presencia de pigmento (2, 5, 12) y presencia de plásmidos de alto peso molecular (4, 6, 7, 8, 16, 21, 22).

Materiales y métodos

Resistencia a antibióticos. Para el análisis de resistencia a antibióticos fueron seleccionadas cepas con diferente capacidad de nodulación y eficiencia (cuadros 1 y 2). Fueron usados antibióticos a diferentes rango de concentración (µg/ml): rifampicina (Rif): 10 -100, cloran-fenicol (Cl), 5 -100; sulfato de estreptomicina (Sm), 5 - 50; vancomicina (Van), 5 -35; espectinomicina (Sp), 5 - 40 y ampicilina (Ap), 5- 50; tomando en cuenta resultados de resistencia a antibióticos en Rhizobium (1, 14).

Análisis de nodulación. Las propiedades simbióticas de las diferentes cepas fueron examinadas en L. meridanus. Las semillas esterilizadas superficialmente con hipoclorito de sodio al 1% durante 15 min y lavadas con agua destilada estéril fueron sembradas en cajas de Petri con medio Jensen e incubadas en la oscuridad a 25ºC, y una vez germinadas, se colocaron en tubos Nutman con medio Jensen (29). Diez plántulas con la primera hoja verdadera fueron inoculadas con 2 ml del cultivo bacteriano correspondiente, crecido en TY hasta una DO [densidad óptica a 620 rm de 0,5 (10⁷ - 10⁸ cel/mL, dependiendo de la cepa)]. Para la inoculación todas las cepas fueron lavadas dos veces con una solución de buffer fosfato, diluido a la mitad. Las plantas crecieron en condiciones de 16 h diarias de luz a 22 ºC. El sistema radical fue examinado semanalmente para evaluar la aparición de nódulos. Según Hartman (10) la eficiencia de una cepa está dada fundamentalmente por la cantidad de materia seca producida por las plantas inoculadas y comparada con un control no inoculado; de manera tal, que en este trabajo la eficiencia fue evaluada determinando peso seco de las plantas. Al cabo de 8-9 semanas los nódulos fueron contados y medidos, y las plantas de cada tratamiento fueron secadas en la estufa a 100 º C durante 48 h hasta peso continuo. Los nódulos se clasifican de acuerdo al tamaño en grande (Q), mediano (M) y pequeño (P). El número de nódulos ponderados por planta se calculo utilizando la ecuación: (NG+NM+NP)/Ptas totales, donde: NG: Nódulos grandes. NM: Nódulos medianos. NP: Nódulos pequeños.

Cuadro 1. Caracteristicas de cepas de Bradyrhizobium sp: nodulación y formación de pigmento.

Nodulación: +pocos nódulos, ++algunos nódulos, +++numerosos nódulos, generalmente pequeños, ++++numerosos nódulos grandes y pequeños. - sin nódulo Pigmentación : +presencia de pigmentos, -ausencia de pigmentos.

Cuadro 2. Cepas de otras especies de Rhizobium y Bradyrhizobium.

* Aislado de Macroptillium sp.
** No conocida.

Perfil de plásmidos. El perfil de plásmidos de las cepas bacterianas fue visualizado de acuerdo al método de la lisis alcalina descrito en Maniatis et al. (17) y modificado al permitir la precipitación del ADN en alcohol isopropílico durante 24 h. El estudio se realizó en las cepas 5, 107, 102, 105, 103, 118, 120, 505, 508, 2004, 2006, 2007, 2011, 2012, 4008, 4013 y 4018 de Bradyrhizobium sp; en las cepas 41 y L530 de Rhizobium meliloti y C58 de Agrobacterium tumefaciens.

Resultados y discusión

De las 22 cepas de Bradyrhizobium sp. estudiadas, 17 fueron infectivas, mostrando gran variabilidad en esta característica como se muestra en los cuadros 1 y 3. Para determinar las diferencias se analizó la capacidad de nodulación en 21 cepas al igual que el número de nódulos y el peso seco (cuadro 3). El 27,2 % de las cepas no es infectiva y el número de nódulos fue variable de 4, 6, 10,11, 13, 17, 23, 26, 32 y 46, presentándose éste último con una frecuencia de 4,76 % (cuadro 3). Los números de nódulos 7 y 14 aparecieron con una frecuencia de 9,52 % ambos. Cuando se compara el peso seco de las diferentes cepas (cuadro 3) se observa que la cepa 4018 no es nodulante y tiene menor cantidad de materia seca (8,93 mg) que el control (11,00 mg), lo que puede ser explicado por diferencias intrínsecas de las plantas. La cepa 102 que es nodulante, pero con 10 nódulos pequeños y 1 mediano, acumuló una cantidad de materia seca (13,99 mg) muy cercana al control; posiblemente las características intrínsecas y nódulos ineficientes pueden explicar este comportamiento. Las cepas 3009 y 120 presentan la relación Nd.Pd / Nº Pt muy parecidas, pero la acumulación de materia seca y el número de nódulos es muy diferente, indicando una alta efectividad de los 7 nódulos de la cepa 120. Las cepas 3004, 2007 y 105 muestran NdPd / Nº Pt similares, pero 3004 acumuló menor cantidad de materia seca. Entre 113 y 505 el incremento de peso seco no es muy grande. La cepa 2006 presenta la mayor acumulación de materia seca (37,22 mg/pt), por encima de 5017 y 2006 y forma el mayor número de nódulos, 46 en total.

No se observa ninguna regularidad entre la capacidad de nodulación (presencia, Nº y tamaño de nódulos) y la capacidad de incorporar materia seca en las diferentes cepas . La cepa 3010 con solo 4 nódulos incorpora 22,03 mg de materia seca, mientras la 2006 con 46 nódulos de diferente tamaño incorpora 37, 22 mg y la 5017 con 31 nódulos (23 grandes) solo incorpora 37,17 mg de materia seca. Sin embargo, cepas como 2005, 2006 y 2007, todas aisladas de una misma planta, presentan gran cantidad de nódulos y alta eficiencia medida como incorporación de materia seca. Las cepas 2006, 2007, 5004 y 5017 también presentan resistencia a un amplio espectro de antibióticos (cuadro 4) lo cual permitiría la inoculación de estas cepas y un buen rendimiento en la fijación y seguimiento en el suelo en condiciones de laboratorio. La capacidad de nodulación y la eficiencia de una cepa son finalmente el resultado de las interacciones especificas de genotipo bacteriano - genotipo vegetal y de condiciones del medio ambiente que permiten la expresión de los genes simbióticos. Por lo tanto, en una población de bradirizobios como la estudiada es normal conseguir diferencias de este tipo.

Resistencia a antibióticos. El cuadro 4 presenta los patrones de resistencia/sensibilidad a antibióticos de 10 cepas de Bradyrhizobium sp. dos de R. meliloti, una de R. trifolii y una de R. cowpea.

Todas las cepas de Bradyrhizobium sp., presentan resistencia a más de un antibiótico. Las cepas 2006 y 2007 poseen resistencia a los 7 antibióticos y la cepa 2012 mostró resistencia para los 6 antibióticos examinados; estas cepas fueron aisladas de la misma planta. Las cepas 5004 y 5017 tienen un patrón de resistencia parecido, aunque 5017 no es resistente a rifampicina. Los patrones de resistencia de 105, 110, 3010 y 4017 son muy diferentes entre ellos. Se observan grupos de patrones tales como 2006, 2007 y 2012 con resis-tencia a rifampicina, cloranfenicol, estreptomicina, vancomicina, espectinomicina y ampicilina; la resistencia a kanamicina no fue probada en la cepa 2012. Las cepas 105, 110 y 2004 tienen el mismo nivel de resistencia a espectinomicina, pero 105 y 110 se diferencian de 2004 porque son resistentes a los niveles de cloranfenicol ensayados. La cepa 2004, a pesar de ser aislada de la misma planta que 2006 y 2007, no presenta resistencia a cloranfenicol, kanamicina, vancomicina y ampicilina. En la cepa 3010 no fue probada la resistencia a kanamicina y vancomicina. y la cepa 4017 es sensible a rifampicina, cloranfenicol y vancomicina, siendo resistente solo a espectinomicina. Las cepas 5004 y 5017 son muy parecidas, siendo sensible ambas a kanamicina, 5004 tiene menor nivel de resistencia a cloranfenicol y 5017 es sensible a rifampicina.

Cuadro 3. Peso seco, tamaño y Nº de nódulos, Nº de nódulos ponderados/ planta y peso seco trat/ peso seco control de plantas de Lupinus meridanus inoculadas con cepas de Bradyrhizobium sp.

Tamaño de nódulos : G= grande; M= mediano; P= pequeño Ndpd / Pt = Nº de nódulos ponderados por planta. Incremento de peso seco: Ps - ct (mg)= Peso seco de la muestra - peso seco del control - = sin nódulos

Cuadro 4. Niveles de resistencia a varios antibióticos de cepas de Bradyrhizobium sp y especies de Rhizobium.

* No probado = NP*
- Ningun crecimiento; Sensibilidad.

A las cepas de R. meliloti L530 y B19, R. trifolii A16 y R. cowpea 2453, se les estudió su patrón de resistencia /sensibilidad a antibióticos para tener una referencia de la posible relación entre infectividad, efectividad, resistencia a antibióticos y su perfil de plásmidos en cepas de Rhizobium spp. L530 presentó resistencia a todos los antibióticos, B19 es sensible a rifampicina y kanamicina; A16 se parece a L530, pero es sensible a rifampicina.

Estos resultados son comparables a los observados en poblaciones de R. phaseoli (1) y de R. trifolii (14), donde cada cepa tiene un patrón de resistencia a antibióticos muy particular, indicando que son una población muy heterogénea. Beynon y Josey (1) observaron 56 tipos de patrones de resistencia en 259 cepas estudiadas.

Según Hartman (10) el espectro de resistencia intrínseca a antibióticos pone de manifiesto la gran diversidad genética en las poblaciones de Rhizobium, por lo tanto patrones de resistencia a antibióticos en cepas silvestres de Bradyrhizoium sp. permiten separarlas entre sí y hacer un seguimiento fácil cuando son inoculadas en el campo.

Formación de pigmento. La formación de pigmento pardo durante el envejecimiento se observa en las cepas 5, 105, 2006, 2007 y 4018 (cuadro 1). Este pigmento fue formado en placas de Petri con MR o TY y en tubos con MR. Las cepas 2005 y 2006 formaron pigmento en medios con antibióticos. Dada la formación constante de pigmento en estas cepas, esta característica puede ser usada como marcador genético. Numerosas especies bacterianas producen pigmentos como carotenoides y antocianinas cuyos determinantes genéticos se encuentran en plásmidos (2). En Erwinia herbicola (5) la presencia de pigmentos está relacionada con un plásmido de 500 kb; en R. phaseoli (2) y R. leguminosarum (12) genes requeridos para la síntesis de melanina también lo son para la fijación de nitrógeno.

Perfil de plásmidos. La evidencia física de la presencia de plásmidos en 17 cepas de Bradyrhizobium sp. es mostrada en las figuras 1, 2 y 3. Rhizobium meliloti 41, L530 y Agrobacterium tumefaciens C58 poseen plásmidos de alto peso molecular. De 17 cepas estudiadas 10 poseen plásmidos. En el género Rhizobium los genes simbióticos se encuentran en plásmidos (pSym) (4, 10, 19, 21). Para el caso de las funciones simbióticas en el género Bradyrhizobium no se puede asegurar que éstas se encuentren relacionadas con la presencia de material extracromosómico.

En B. japonicum los genes simbióticos están en los cromosoma de manera que la presencia de plásmidos de alto peso molecular en las cepas 107, 105, 103, 118, 120, 2004, 2006, 2007, 2012 y 4008 no se puede relacionar con su capacidad de nodulación y de fijación (20, 24, 26). La cepa 103 presenta un plásmido de peso molecular más bajo (figura 1). Estos plásmidos puden tener las mismas funciones que en Azospirillum (7) y Enterobacter (15).

Figura 1. Electroforésis en gel de agarosa de aislados de las cepas de R. meliloti: (a) 41 y (b) L530; (j) A. tumefaciens C58; Bradyrhizobium sp.; (c) 5; (d) 107; (e) 102; (f) 105; (g) 103; (h) 118; (i) 120. Las flechas indican la posición de los plásmidos de las cepas de R. meliloti 41 y L530 y A. tumefaciens C58.

Figura 2. Electroforésis en gel de agarosa de aislados de las cepas de R. meliloti: (a) 41 y (b) L530; (k) A.. tumefaciens; Bradyrhizobium sp.; (c) 505; (d) 505; (e) 508; (f) 2004; (g) 2006; (h) 2007; (i) 2011; (j) 2012. Las flechas indican la posición de los plásmidos de las cepas de R. meliloti 41 y L530 y A. tumefaciens C58.

Figura 3. Electroforésis en gel de agarosa de aislados de las cepas de R. meliloti: (a) 41 y (b) L530; (k) A.. tumefaciens C58 (f); Bradyrhizobium sp; (c) 4008; (d) 4013 y (e) 4018. Las flechas indican la posición de los plásmidos de las cepas de R. meliloti 41 y L530 y A.. tumefaciens C58.

La presencia de plásmidos de alto peso molecular (aproximadamente 200 MD) se puede observar en cepas nodulantes y no nodulantes lo cual confirma una vez más que en el género Bradyrhizobium los determinantes genéticos para la nodulación y la fijación de nitrógeno no se encuentran en plásmidos como el género Rhizobium.

Las cepas 102, 103, 105, 107, 118 y 120 son todas aisladas de nódulos de una misma planta de L mutabilis y a excepción de 102 todas presentan plásmidos. Igual sucede con las cepas 2004, 2006, 2007, 2011 y 2012 aislados de una planta de L. meridanus, donde solo 2011 no presenta plásmidos. Lo anterior indica que posiblemente la población de bradyrizobios que ha infectado a una sola planta, puede originarse de una población base que se ha multiplicado y puede existir pérdidas de material genético plasmídico en algunos de sus miembros.

En las cepas 2006, 2007 y 2012 resistentes a rifampicina también se evidenció la presencia de plásmidos de alto peso molecular (figuras 1 y 2) posiblemente relacionados con la resistencia a rifampicina; en las cepas 3010 y 5004 no se determinó presencia de plásmidos.

Plásmidos de alto peso molecular también están presentes en las cepas de R. meliloti L530 (4,5) y B19, R. trifolii A16 y R. cowpea 2453 (trabajo no publicado) las cuales son infectivas , efectivas y con resistencia a varios antibióticos. Estos plásmidos están relacionados con la capacidad de fijación (2, 4, 15, 22, 23) y posiblemente con la resistencia a antibióticos como sucede en R. trifolii (8).

El pigmento marrón se observó en las cuatro cepas con plásmidos (105, 2006, 2007 y 4018) y en la 5 que posee plásmidos. Esto contradice lo encontrado en otras especies de bacterias donde la formación de melanina está codificada en un plásmido; sin embargo, es posible que también haya información codificada para la formación de pigmento en otro componente del genoma bacteriano ya que la cepa 5 fue varias veces analizada para determinar la presencia de plásmido y siempre fue negativo el resultado, sin embargo, siempre formó pigmento marrón.

En estudios de poblaciones naturales de Rhizobium y Bradyrhizobium, Hartmann (11) determinó que son heterogéneas; su diversidad utilizando diferentes métodos de caracterización es importante sin que el nivel de diversidad obtenida por los diferente métodos sean siempre correlacionado, Este autor confirma que el estudio de cualquier característica en poblaciones de Rhizobium y Bradyrhizobium pone en evidencia la diversidad de fenotipos simbióticos.

Estos resultados nos llevan a concluir que la población de Bradyrhizobium sp. aislada de nódulos de L. meridanus y L. mutabilis provenientes del páramo merideño, presenta gran diversidad en su capacidad de nodulación, eficiencia, formación de pigmento y presencia de plásmidos de alto peso molecular. Tal diversidad permite seleccionar las cepas más eficientes y con marcadores naturales para ser usadas como inoculantes en el campo.

Conclusiones

El estudio de cepas de Bradyhrizobium spp. aisladas de L. meridanus y L. mutabilis, ha mostrado que son una población heterogénea con diferencias en su capacidad de nodulación, fijación de nitrógeno, resistencia a antibióticos, formación de pigmentos y perfil de plásmidos. Las cepas 105, 505, 120, 2007, 5017 y 2006, eficientes en la fijación de nitrógeno, medida como incorporación de materia seca, pueden ser usadas como inoculantes en campo y su seguimiento puede realizarse con marcadores como la resistencia a antibióticos y su perfil de plásmidos.

Estos resultados indican que la población de Bradyhrizobium spp. aislada de nódulos de L. meridanus y L mutabilis provenientes del páramo merideño, presenta gran diversidad en su capacidad de nodulación, eficiencia, formación de pigmento y presencia de plásmidos de alto peso modecular. Tal diversidad permite seleccionar las cepas más eficientes y con marcadores naturales para ser usadas como inoculantes en el campo.

Agradecimientos

Al Dr. Manuel Dagert por su colaboración en la visualización de los plásmidos. A la Sra. Beatriz Urrecheaga por la preparación de los medios de cultivo y al Sr. Sócrates Pérez por la reproducción del material fotográfico.

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