Rev. Fac. Agron. (LUZ). 1999, 16: 509-516
Actividad metabólica de cepas de Trichoderma spp para el
control de hongos fitopatógenos del suelo.
Metabolic activity of Trichoderma spp. isolates for a
control of soilborne phytopathogenic fungi.
Recibido el 27-05-1999 l Aceptado
el 12-09-1999
1. Departamento de Microbiología, Laboratorio de Bacteriología, Instituto de
Investigaciones de Sanidad Vegetal , Calle 110 # 504 esq. 5ta F, Playa. E-mail:
inisav@ceniai.inf.cu
M. Stefanova1, A. Leiva1, L. Larrinaga1,
M. F. Coronado1
Resumen
Entre los hongos utilizados para el biocontrol de patógenos fúngicos
de suelo, varias especies de Trichoderma han sido merecedoras de una mayor
atención, su actividad resulta en una combinación de micoparasitismo y producción de
metabolitos. Se estudió la actividad metabólica de cuatro aislamientos de Trichoderma spp. definidos como promisorios para el control de diversos patógenos del suelo,
entre ellos Phytophthora nicotianae, Phytophthora capsici, Rhyzoctonia solani y Pythium spp. Los aislamientos A-34 (Trichoderma harzianum), A-86 (Trichoderma
viride), A-53 (Sección Trichoderma) y PR-617 (Sección Longibrachiatum)
producen metabolitos no volátiles con actividad antifúngica que reducen el crecimiento
de Phytophthora nicotianae y Rhizoctonia solani en medio de cultivo
enmendado con los filtrados a partir de cultivos líquidos donde fueron cultivadas las
cepas antagónicas. La hidrólisis del almidón, gelatina, carboxymetilcelulosa, quitina y
caseina indicó la presencia en los filtrados de las enzímas líticas:
carboxymetilcelulasa, quitinasa y b1,3 gluconasa, entre otras. El aislamiento A-86 emana
además una lactona volátil con aroma a coco, probablemente 6 pentil alfa pirona que
inhibe el crecimiento de P. nicotianae. Los metabolitos causan a nivel celular
vacuolación, granulación, coagulación, desintegración y lísis.
Palabras clave: Trichoderma, metabolitos, biocontrol
Abstract
Various species of Trichoderma have received more attention,
between the fungi used for biocontrol of soilborne pathogens.The effectiveness of Trichoderma lies in a combination of mycoparasitism and production of antifungal metabolites. The
metabolic activity from four promissory Trichoderma isolates for the biological
control of the most important soilborne plant pathogens: Phytophthora nicotianae,
Rhizoctonia solani y Pythium spp was studied. The isolates A-34 (Trichoderma
harzianum), A-86 (Trichderma viride), A-53 (Section Trichoderma) and
PR-617 (Section Longibrachiatum) produced non volatiles metabolites with
antifungical activity which reduce P. nicotianae and R. solani growth in medium
emended with filtrates from liquid cultures, where the antagonic isolates were cultivated.
The hidrolysis of starch, gelatine, caseine, carboxymethylcellulose and chitin indicated
the presence of the lythic enzimes carboxymethylcellulase, chitinase and b- 1,3 gluconase
among others in the filtrates. The isolate A- 86 also produced a volatil coconut - like
smelling lactone, probably 6- pentyl alpha pyrone, which inhibits P.nicotianae growth. Metabolites cause vacuolation, granulation, coagulation, desintegration and lysis
at the cell level.
Key words: Trichoderma, metabolites, biocontrol.
Introducción
El biocontrol actualmente ocupa un lugar importante dentro de las
prácticas de manejo de enfermedades de las plantas causadas por los patógenos fúngicos
del suelo, principalmente de los géneros Rhizoctonia, Sclerotium, Pythium,
Phytophthora y Fusarium entre otros. Las especies de Trichoderma poseen
buenas posibilidades en este sentido como hiperparásitos competitivos que producen
metabolitos antifúngicos y enzimas hidrolíticas a los que se les atribuyen los cambios
estructurales a nivel celular, tales como vacuolación, granulación, desintegración del
citoplasma y lisis celular (1, 2, 8,10, 16).
En Cuba a partir de 1990 se efectuaron diversos estudios dirigidos al
biocontrol de hongos del suelo patógenos al tabaco, hortalizas y otros cultivos con
aislamientos de Trichoderma que fueron seleccionados "in vitro"
por su elevada capacidad hiperparásita y posteriormente utilizados en forma de
biopreparados para combatir Phytophthora nicotianae, Phytophthora capsici, Rhizoctonia
solani y otros fitopatógenos en condiciones de campo (11,12).
El presente trabajo se realizó con el objetivo de conocer la presencia
y participación de los metabolitos en la inhibición de los fitopatógenos que estas
cepas de Trichoderma controlan.
Materiales y métodos
Los cuatro aislamientos de Trichoderma utilizados y sus
especificidades se muestran en el cuadro 1. Para demostrar la presencia de metabolitos no
volátiles, las cepas se cultivaron en los medios de cultivo líquidos papa-dextrosa (PD)
y melaza-levadura torula (ML), este último empleado en la producción de biopreparados
del hongo. Los frascos con 200 ml de los medios se inocularon con discos ( uno por frasco)
de cultivos de 48 horas de crecimiento, la reproducción se efectuó de forma estática a
temperatura entre 27-30ºC.
Diez días despues se tomaron muestras del líquido o filtrados
obtenidos mediante filtración con papel que luego fueron, centrifugados a 15000 rpm,
durante 20 min, y por último el sobrenadante fue pasado por el filtro milipor de 0,22
µm.
Cuadro 1. Especificaciones de los aislamientos de Trichoderma estudiados.
No de aislado |
Nivel de identificación |
Efectividad |
A-34 |
Trichoderma |
Pythium |
|
harzianum |
aphanidermatum |
|
Rhizoctonia solani |
|
|
(tomate y pimentón) |
|
|
Phytophthora capsici |
|
|
(pimentón) |
|
|
Phytophthora. |
|
|
parasitica (tomate) |
|
A-53 |
Sección Trichoderma |
Phytophthora |
|
nicotianae (tabaco) |
|
|
R. solani |
|
|
Pythium sp. |
|
A-86 |
Sección Trichoderma |
R. solani (tomate) |
|
T. viride |
Fusarium oxysporum (tomate) |
|
P. parasitica (tomate) |
|
PR- 617 |
Sección |
P. nicotianae (tabaco) |
|
Longibrachiatum |
|
Los filtrados fueron mezclados con el medio de cultivo
papa-dextrosa-agar (PDA) en una proporción de 1:1. Se comparó el tamaño de las colonias
de R. solani y Phytophthora nicotianae, cepas Rs-21 y 223 respectivamente,
crecidas en el medio enmendado y en las placas que contenían PDA solamente.
La actividad hidrolizante de los filtrados fue comprobada en medios de
cultivo con almidón, gelatina, carboxymetilcelulosa, quitina y caseína. El líquido fue
depositado en los orificios a razón de 200µl y se registró la presencia de zona
hidrolizada alrededor, una vez revelada la reacción con solución de yodo al 1%.
La producción de metabolítos volátiles se estudió cultivando la
cepa antagónica en la base de la placa Petri sobre el medio PDA, y en la tapa, el hongo
fitopatógeno, en este caso se empleó la cepa 223 de P. nicotianae. Las placas
fueron selladas con cinta plástica y el efecto de los volátiles se comprobó por la
comparación del diámetro de las colonias del patógeno con sus testigos a los 3 y 7
días del montaje.
La degradación de la celulosa por las cepas se determinó en tiras de
papel de filtro introducidas en un medio líquido de sales, distribuido en tubos. A los 15
y 20 días de incubación se comprobó la desintegración del papel con respecto al
testigo no inoculado. Para determinar la presencia de enzimas celulíticas, las cepas se
cultivaron en el medio de sales al que se le añadió celulosa más xylosa, como precursor
de la síntesis de las enzimas, ambos al 1%. Luego de 21 días de incubación, se separó
el sobrenadante y una vez filtrado se depositó en los orificios practicados en medio
agarizado con carboxymetilcelulosa al 1%, además se evaluó la existencia de las otras
enzimas líticas anteriormente mencionadas.
Se comprobó el efecto sobre el micelio fúngico de los metabolitos
producidos por las cepas A-53, A-34 y PR-617. Para esto se tomaron fragmentos del micelio
de una colonia de P. nicotianae de 7 días de crecida en PDA que se colocaron en
tubos con 1 ml de los filtrados, luego de 3 días de incubación a 27ºC se
hicieron observaciones en el microscopio óptico. El testigo fue montado con agua
destilada estéril.
Se realizó un análisis de varianza utilizando el sistema STATITCF
para un 5% de probabilidad de error.
Resultados y discusión
Los metabolitos volátiles producidos por las cepas de Trichoderma provocaron un desarrollo micelial menos denso y reducción del tamaño de la colonia de P.
nicotianae en comparación con el testigo. La cepa A-86 produjo un efecto
fungistático notable sobre el hongo fitopatógeno (cuadro 2).
Otros autores (4,13) han mencionado, como parte del mecanismo de
biocontrol, el efecto biológico fungistático de sustancias volátiles emanadas por
sistemas vivos incluyendo a Trichoderma, aunque en la mayoría de los casos no se
especifica la naturaleza de los mismos. Bengston et al.(1) determinaron la
presencia de una lactona volátil, 6 -pentyl alfa pirona, con fragancia a coco, como
metabolito principal de Trichoderma viride. La cepa A-86 perteneciente a esta
especie es caracterizada por el mismo aroma, que sugiere la presencia del mencionado
metabolito o de otro con características similares.
Los filtrados de los aislamientos estudiados, mezclados con el medio de
cultivo, limitaron el crecimiento de las especies fitopatógenas por la presencia de
metabolitos biológicamente activos (cuadro 3).
Igualmente hidrolizaron la gelatina, caseína, leche,
carboxymetilcelulosa (CMC) y la quitína, debido a la existencia de enzimas líticas de
carácter proteolítico y celulítico, además de la enzima quitinasa. Los filtrados
obtenidos a partir del medio basal enmendado con xylosa y celulosa tuvieron marcada
actividad lítica sobre la CMC, no así sobre las proteínas, lo cual puede atribuírse a
una mayor producción de enzimas del complejo celulasa en este medio. Estos filtrados
también hidrolizaron la quitina y el almidón, esto último señala la existencia de
enzimas que atacan enlaces glucosídicos (cuadro 4).
Cuadro 2. Efecto de los metabolitos volátiles producidos por las
cepas de Trichoderma contra P. nicotianae
Cepas |
Diámetro de la colonia de P. nicotianae (mm) |
|
Primer ensayo |
Segundo ensayo |
|
3 días |
7 días |
3 días |
7 días |
A-34 |
22,3a |
37,2d |
21,7b |
35,3b |
A-53 |
24,1a |
39,0c |
19,3c |
34,6b |
A.86 |
18,0b |
30,0e |
11,0d |
19,2c |
PR |
22,0a |
41,5b |
18,3c |
34,8b |
Testigo |
23,5a |
47,3a |
24,5a |
45,75a |
CV= 5,6%. CV= 2,4%. CV=4,7%. CV= 2,6%. DE= 1,23. DE= 0,95. CV= 0,89.
DE= 0,88.
Todas las cepas objeto de estudio colonizaron el papel de filtro y
provocaron su desintegración a los 15-20 días. En este sentido, Gomez et al.(6)determinaron
que cepas de T. viride y T. harzianum poseen actividad carboxymetylcelulasa,
b-glucosidasa, xylanasa y b-xylosidasa comparable con la de Trichoderma reesei respecto a la producción de celulasa en papel de filtro. La cepa PR-617 mostró poca
actividad en esta prueba, sin embargo, en el filtrado a partir de la misma se detectó la
presencia de enzimas celulíticas, posiblemente estimuladas por el sustrato específico
empleado. La especie T. longibrachiatum, con la cual es afín dicha cepa, no induce
normalmente niveles notables de esta enzima y necesita estimulantes para la producción
enzimática (9).
Cuadro 3. Efecto de los metabolitos no volátiles sobre P.
nicotianae y R. solani
Cepas |
Diámetro de las colonias (mm) |
|
P. nicotianae (ML / PD) |
R. solani (ML / PD) |
A-34 |
20,2c / 22,1c |
38,3b / 37,4c |
A-53 |
23,3b / 21,5c |
39,2b / 35,4d |
A-86 |
25,0b / 27,3b |
40,7b / 41,3b |
223(P. nicotianae) |
38,0a |
- |
Rs-21 (R. solani) |
- |
52,2a |
|
CV=3,4% CV= 2,7% |
CV=2,6 CV=2,4 |
|
DE=0,91 DE= 0,73 |
DE=1,09 DE=1,01 |
ML: medio melasa - levadura , PD: medio papa dextrosa.
Cuadro 4. Actividad lítica de los filtrados sobre diferentes
substratos.
Substratos |
PRc |
PRs |
86c |
86s |
53c |
53s |
34c |
34s |
ML |
PD |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
53 |
34 |
53 |
34 |
Leche |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
Caseína |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
Almidón |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Gelatina |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
Quitina |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
CM Celulosa |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
C: Medio basal enmendado con celulosa + xylosa (1%). S: Medio basal
enmendado con xylosa (1%). ML: Medio melaza-levadura torula. PD: Medio papa - dextrosa.
El efecto directo de los metabolitos de los aislamientos A-34, A-53 y
PR-617 sobre el micelio de P.nicotianae se expresó en deformaciones del micelio,
desplazamiento del contenido citoplasmático, afinamiento y lisis de las paredes
celulares, resultados que ofrecen respuesta al origen de los cambios estructurales
microscópicos que ocurren en el contacto entre el patógeno y las cepas de Trichoderma y corroboran los obtenidos anteriormente por Cherif y Benhamou (2).
La producción activa de metabolitos extracelulares por las especies de Trichoderma y su importancia en el biocontrol ha sido señaladas en numerosos
estudios (3, 4, 6, 7, 8, 10), la manipulación genética de las proteinasas, incluso es una
forma promisoria para incrementar la actividad biológica de T.harzianum (4, 5).
La detección de quitinasa sobre substrato específico indica la biosíntesis de esta
enzima por las cepas objeto de estudio. Cherif y Benhamou (2) y Uloha y Peberdy (16)
informaron la existencia de quitinasa entre los metabolitos líticos de Trichoderma y sugirieron su importancia en el biocontrol como enzima micolítica. La combinación
incluso de b 1,3 glucanasa y quitinasa es más efectiva en la inhibición de los hongos
(8, 10, 17).
Los aislamientos A-34, A-53, A-86 y PR-617 se emplean en forma de
biopreparados para combatir los hongos del suelo en tabaco, hortalizas, granos y otros
cultivos con una aceptación muy favorable por el agricultor. Parte de la efectividad de
los mismos se puede atribuir a la producción de los metabolitos y su efecto sobre los
patógenos, tal y como lo demuestran los resultados anteriormente expuestos.
Conclusiones
El crecimiento de Phytophthora nicotianae y Rhizoctonia
solani se puede reducir mediante metabolitos no volátiles con actividad antifúngica
producidos por los aislamientos A-34 (Trichoderma herzianum), A-86 (Trichoderma
viride), A-53 (Sección Trichoderma) y PR-617 (Sección longibrachiatum).
Se constató en los filtrados la presencia de enzimas líticas,
carboxymetilcelulosa, quitinasa y b 1,3 gluconasa mediante la hidrólisis del almidón,
gelatina, carboxymetilcelulosa, quinina y caseina.
El aislamiento A-86 emana una lactosa volátil, probablemente con una
estructura química de 6 pentil alfa pirona que inhibe el crecimiento de P. Nicotianae.
Los metabolitos evaluados cau-san a nivel celular vacuolación,
granulación, coagulación, desintegración y lisis.
Los aislamientos A-34, A-53, A-86 y PR-617 se pueden emplear como
biopreparados que producen metabolitos capaces de combatir hongos del suelo en tabaco,
hortalizas, granos y otros cultivos con aceptación muy favorable por parte del
agricultor.
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